[其他]雞蛋清殼素的分離方法

無效

• 申請號: 86100617
• 申請日: 1986-01-16
• 公開（公告）號: CN86100617A
• 公開（公告）日: 1986-11-12
• 發明（設計）人: 維托·吐克;佐茨·布辛
• 申請（專利權）人: 克爾克制藥廠有限公司
• 主分類號: B01D15/08
• 分類號: B01D15/08;A61K37/02
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣,辛敏忠

本發明涉及雞蛋清殼素的分離，含有殼素（Cystatin）的抗病毒劑及其作為病毒蛋白質水解過程抑制劑的應用。

已知生物組織含有蛋白（水解）酶以及相應的抑制劑，它們參與生物體在機體正常及致病的情況下的各種生物功能的控制和調節過程。因此各種動物病毒的蛋白（水解）酶，例如細小RNA（核糖核酸）病毒，在病毒的復制中起著重要的作用。病毒蛋白酶將前體蛋白分解成較小的產物，并將分解產物裝配成更大、更復雜的病毒結構（J.Putnak????and????B.Phillips，Microb.Rev.45，287（1982））。因此，蛋白酶抑制劑也表現為潛在的治療物。

已知細小RNA病毒蛋白酶對巰基蛋白酶抑制劑非常敏感，例如汞制劑，碘乙酸鹽，α₂-巨球蛋白及其它（B.D.Korant，K.Lonberg-Holm and P.Lacolla，in：Targets for the design of antiviral agents，E.De Clercg and R.T.Walker，eds.，Plenum Press，pp.61-98，1984）。巰基蛋白酶的一種特異抑制劑也是低Mr蛋白雞殼素，它是從蛋清中分離出來的（A.Anastasi，M.A.Brown，A.A.Kembhavi，M.J.H.Nicklin，C.A.Sayers，D.C.Sunter and A.J.Barrett，Biochem.J.211，129-138，1983;V.Turk，et al.，Hoppe-Seyler′S????Z.Physioi.Chem.364，1487-1496，1983）。雞殼素以兩種形式被分離出來，其等電點不同，PI5.6和6.5。其氨基酸序列已經確定（V.Turk????et????al.，Biochem.J.214，813-817，1984）。已發現雞卵殼素為植物蛋白酶木瓜蛋白酶和哺乳動物蛋白酶組織蛋白酶B.H和L的有效抑制劑（A.Anastasi????et????al.，Biochem.J.211，129-138.1983）。

雖然已經公開的方法業已給出了純的產物，但產率相當低。

因此，作為本發明的首要方面，我們提出了一種新的，從天然來源的雞蛋清中分離雞殼素的方法。將雞蛋清水溶液加熱至最高80℃（60-70℃間任意溫度）沉淀非活性蛋白質。溶液隨后冷卻并離心。往上清液中加入lM????Nacl并在羧甲基（Cm）木瓜蛋白酶-Sepharose????4B上在PH8.0，1.0M????Nacl存在的情況下用0.01M????Tris緩沖液進行親和層析。抑制劑殼素用0.01M????PH11.5????NaoH洗脫，超濾或冷凍干燥濃縮，并在0.01M????Tris緩沖液PH8.0的條件下于Sephadex????G50上分離。收集抑制活性成份，超濾濃縮，在單Q柱上（Pharmacia????Sweden）以起始緩沖液為0.01M????PH8.0????Tris的快速蛋白液相層析（FPLC）的方法分離，往起始緩沖液中加入0.5M????Nacl洗脫出雞殼素抑制劑。該抑制劑被洗脫出兩個抑制峰，PI值為5.6和6.5，用等電聚焦法測定。

本發明應用的所有化學制劑都是商業上已知并可買到的。本發明分離雞殼素的方法技術上簡單而且比到目前為止所描述過的方法得到的產率更高。

在我們的試驗中，我們驚奇地發現雞蛋清殼素抑制細小RNA病毒的水解蛋白活性。細小RNA病毒包括脊髓灰質炎病毒，鼻病毒及A型肝炎的致病因子與口足病病原。

雞蛋清殼素的抑制活性可被列于表中的結果所證實。因此本發明的下一個目的就是雞蛋清殼素在治療細小RNA病毒侵染的哺乳動物和鳥類，以及其它所有的由相應病毒感染的生物體上的應用。

本發明的另一目的是含有生理上可接受劑量，并對細小RNA病毒水解蛋白活性的抑制有效的雞蛋清殼素的抗病毒劑。這些抗病毒劑的配制和應用在本專業領域技術人員的知識和經驗的范圍之內。

應該指出的是，雖然在本申請當中只討論了根據本發明方法制備的雞蛋清殼素，但我們還提出了用遺傳工程方法制取的雞殼素的應用。

本發明用下述實例進行說明，但不局限于此。

雞蛋清殼素的分離

實施例1