[其他]一種共價活化的固定化酶載體

無效

• 申請號: 86100565
• 申請日: 1986-04-30
• 公開（公告）號: CN86100565A
• 公開（公告）日: 1987-11-11
• 發明（設計）人: 樓一心;周文瑜
• 申請（專利權）人: 華東化工學院
• 主分類號: C12N11/02
• 分類號: C12N11/02
• 代理公司: 華東化工學院專利事務所
• 代理人: 金紅,盛志范

本發明屬于生物化學領域，是一種經共價活化的可制備固定化酶的蛋白質載體。

已知的共價活化法制備固定化酶的載體，多用合成載體，例如：多糖類衍生物，氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺，苯乙烯樹脂，多孔玻璃芳香胺衍生物等各種聚合物。由于共價化學鍵較穩定，因此共價法制備的固定化酶，酶和載體之間的結合極其牢固，但上述一類載體的共價活化，控制條件苛刻，反應激烈，操作復雜。對于某些不能予先活化的載體，如果載體通過雙功能用試劑與酶共價偶聯的話，常引起酶蛋白的高級結構發生變化，并導致活性中心的破壞，使酶活力下降。

蛋白質載體提供了酶的天然環境，可予先接枝共價活化，使得固定化條件較溫和，有利于酶活性的保存和穩定性的提高。已有人使用膠原蛋白作固定化酶的載體，但膠原蛋白的制備技術較復雜，是用牛皮、牛肋等組織經處理而得，鋪膜的厚度難以均勻，特別是其機械強度和通透性較差，難于實現工業規模的酶反應過程。此外，用膠原蛋白作載體，所得的固定化酶的比活性較低。

本發明的目的是要尋找一種來源豐富，價格低廉，加工方便，機械強度與通透性好，能予先共價活化，適宜于酶生存的載體，用它制得的固定化酶不僅具有高的比活性，而且便于實現工業規模的酶反應過程。

本發明所指的固定化酶的載體是一種經“共價活化的蠶絲蛋白”，其制備方法有二種：

1.蠶絲蛋白表面羥基的活化（重疊法）

先使蠶絲蛋白在堿性條件下與對β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）反應，使成為具有芳香族氨基的非水溶性載體（對氨基苯磺酰乙基-蠶絲蛋白），然后用鹽酸和亞硝酸鈉處理，生成重氮鹽化合物，即得到本發明所說的經“共價活化的固定化酶載體”（共價活化的蠶絲蛋白），再與酶發生重氮偶合反應，制得固定化酶。

2.蠶絲蛋白表面羧基的活化（酰代疊氮法）

在室溫下，將蠶絲蛋白在甲醇-鹽酸混合液中浸泡數十小時，取出，用水漂洗后，在肼溶液中浸幾小時，得到蠶絲蛋白的酰肼衍生物，再用亞硝酸鈉-鹽酸溶液處理，便成為蠶絲蛋白-酰代疊氮衍生物，即得本發明所說的經“共價活化的固定化酶載體”（共價活化的蠶絲蛋白），再與酶發生重氮偶合反應，制得固定化酶。

本發明的載體-共價活化的蠶絲蛋白有一個最佳活化條件：

即將蠶絲蛋白浸入SESA-2%Na₂CO₃水溶液中，先在80℃左右保溫10分鐘，加入適量無水Na₂CO₃，在80℃下繼續保溫45分鐘，取出，用冰水充分漂洗，然后在0℃下用Na₂NO₂-HCl溶液處理3分鐘，取出后，再用冰水充分洗滌，即得本發明所說的固定化酶載體-共價活化的蠶絲蛋白載體。

經共價活化的蠶絲蛋白，較膠原蛋白有如下顯著優點：

（1）蠶絲蛋白的成份一般由18～20種氨基酸構成，表面帶有比膠原蛋白更多的-OH基團和-COOH基團，因此用它制得的固定化酶的活性和穩定性均比膠原蛋白作載體制得的固定化酶的活性和穩定性要高。例如：用2.5Cm×1.5Cm蠶絲蛋白片料，經共價活化制得的固定化酶（如固定葡萄糖氧化酶），在20ml 1%葡萄糖溶液（作底物）中，pH5.5，溫度30℃下反應半小時，測得其比活性為59nmoles/min·Cm²;同樣條件下，用膠原蛋白固定葡萄糖氧化酶時，測得的比活性僅為17.8nmoles/min·Cm²。

（2）蠶絲蛋白來源豐富，一般市售的絲織物均可作為原料，加工成“共價活化的蠶絲蛋白”-固定化酶的載體，制備上比膠原蛋白要方便的多。

（3）蠶絲蛋白的機械強度和通透性要膠原蛋白好得多，蠶絲蛋白可以制成絲狀，線狀，纖維織物狀等，大大提高了固定化的表面積，這些都有利于工業規模的酶反應過程的進行，而膠原蛋白通常只能鋪成膜狀，其機械強度和通透性均較差。

由上可見，作為固定化酶的載體來說，本發明所述的共價活化的蠶絲蛋白無疑是一種有著廣泛發展前景的載體。

實施例1

載體原料采用2.5×1.5Cm市售的縐絲片料（一種蠶絲蛋白織物，以下簡稱片料）

酶用葡萄糖氧化酶，（以下簡稱酶）

〔1〕固定化酶載體的制備-共價活化的蠶絲蛋白最佳活化條件：