[其他]能表達脫輔基水母發光蛋白(Apoaeq-uorin)的重組DNA載體

無效

• 申請號: 85109740
• 申請日: 1985-12-30
• 公開（公告）號: CN85109740A
• 公開（公告）日: 1987-02-04
• 發明（設計）人: 米頓·約瑟夫·科米爾
• 申請（專利權）人: 佐治亞州大學研究基金會
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N1/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠,顧柏棣

蛋白（Apoaequorin）的重組DNA載體

本發明涉及遺傳工程領域，特別是把脫輔基水母發光蛋白基因插入到重組DNA載體中以在受體微生物菌株中生產脫輔基水母發光蛋白的技術。本申請是1984年12月31日美國專利申請號687903一案的部分繼續申請。

脫輔基水母發光蛋白是一種單肽鏈蛋白質，它可以從發光水母（Aequorea????Victoria）中分離得到。該蛋白含一個與其非共價結合的腔腸動物熒光素分子，結合后稱其為水母發光蛋白（aequorin）。在有鈣離子存在時，水母發光蛋白被氧化，并發出可見光。發光后即可把水母發光蛋白的蛋白部分與熒光素分離并純化出來，然后又可用天然或合成的熒光素與該蛋白部分重新裝配。把鈣離子加到重新形成的水母發光蛋白將再次導致發光。因而，這種脫輔基水母發光蛋白可在許多化學和生化試驗中被用作標記物。

天然的脫輔基水母發光蛋白不是單一化合物而是幾種分子大小不同物質的混合物。把上千個水母（Aequorea）得到的純天然水母發光蛋白在所用各種緩沖液均含有0.1mM????EDTA的非變性條件下，在堿性緩沖液中電泳，然后將電泳后凝膠（0.5cm×10cm）浸在0.1M????Ca????Cl中，發現至少有6個可見的蘭色熒光帶。這個觀查結果與J.R步布林克（J.R.Blinks）和G.C.哈瑞（G.C.Harres）得到的結果一致（刊載在Fed·Proc.1975年34期474頁）。他們在把同樣萃取物用等電聚焦電泳分離時觀察到12條熒光帶。Blinks和Harres之所以觀查到更多種不同大小分子的電泳帶是由于等電聚焦電泳比普通電泳有更高的分辨率。但得到的任何一個帶都不是一種純的肽。

然而，很難從水母或其它天然原料中生產足夠量的水母發光蛋白或脫輔基水母發光蛋白以滿足生物熒光試驗的所需量。因此，急需生產足夠量的商業用脫輔基水母發光蛋白的一種改進方法。

最近發展的技術使人們可以利用迅速而大量生產的微生物合成商業上有用的蛋白和肽，不管它們的天然來源如何，這些技術使人們可以使用遺傳學上合適的微生物合成正常情況下在其它機體中創造的蛋白質和肽。該技術是應用一切生物中存在的遺傳物質DNA和其合成的蛋白質的關系，也就是說蛋白質中氨基酸順序反映了DNA的核苷酸的順序。蛋白質有常見的二十種氨基酸，每種氨基酸都特異地與一種與多種三核苷酸順序相關聯。這種關系構成了遺傳密碼。所有生物的遺傳密碼都是相同或相似的。由于很好地了解到這種關系，核苷酸順序反映著每種蛋白或肽的氨基酸順序。因而，原則上說任何生物都可把相同核苷酸順序翻譯成相同氨基酸順序。

表1

遺傳密碼

苯丙氨酸（Phe）TTK????組氨酸（His）CAK

亮氨酸（Leu）XTY????谷氨酰胺（Gln）CAT

異亮氨酸（Ile）ATM????谷氨酰胺（Asn）AAK

蛋氨酸（Met）ATG????賴氨酸（Lys）AAJ

纈氨酸（Val）GTL????天冬氨酸（Asp）GAK

絲氨酸（Ser）QRS????各氨酸（Glu）GAJ

脯氨酸（Pro）CCL????半胱氨酸（Cys）TGK

蘇氨酸（Thr）ACL????色氨酸（Try）TGG

丙氨酸（Ala）GCL????精氨酸（Arg）WGZ

酪氨酸（Tyr）TAK????甘氨酸（Gly）GGL

終止信號????TAJ

終止信號????TGA

注：每個三聯字母表示DNA從左端5′到右端3′的三個核苷酸。字母代表組成核苷酸順序的嘌呤和嘧啶堿。

A＝腺嘌呤????G＝鳥嘌呤????C＝胞嘧啶

J＝腺嘌呤或鳥嘌呤????K＝胸腺嘧啶或胞嘧啶????L＝腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤????M＝腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶????T＝胸腺嘧啶X表示如果Y是腺嘌呤或鳥嘌呤，

則X就是胸腺嘧啶或胞嘧啶

如果Y是胞嘧啶或胸腺嘧啶

則X就是胞嘧啶

Y表示如果X是胞嘧啶，則Y就是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。

如果X是胸腺嘧啶，則Y是腺嘌呤或鳥嘌呤。

W表示如果Z是胸腺嘧啶和胞嘧啶，則W是胞嘧啶或腺嘌呤;

如果Z是胞嘧啶或胸腺嘧啶，則W是胞嘧啶。

Z表示如果W是鳥嘌呤，則Z是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶;

如果W是腺嘌呤，則Z是腺嘌呤或鳥嘌呤。

QR表示如果S是腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶或胸腺嘧啶則QR是胸腺嘧啶-胞嘧啶;