[其他]膠原酶制備工藝

無效

• 申請號: 85103913
• 申請日: 1985-06-19
• 公開（公告）號: CN85103913A
• 公開（公告）日: 1986-12-24
• 發明（設計）人: 卞祖寧;于保貞;王若駒;張蓓蕾;許海寶;孫憶華
• 申請（專利權）人: 國家醫藥管理局上海醫藥工業研究院
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;//
• 代理公司: 上海市專利律師事務所
• 代理人: 王巍,馮佩玉

本發明屬酶工程或生物工程技術領域。

膠原酶（Collagenase）是一種在生理PH及溫度條件下水解天然膠原蛋白酶，膠原酶不僅是細胞分離的重要工具酶，而且是外用清瘡脫痂，局部注射治療椎脊盤突出癥的良好藥物。

1927年Ssadilow首先使用了“Collagenase”的名稱，1938年Grassmenn第一次證明膠原酶的存在，它能作用于天然膠原分子的特異性螺旋體結構部份，通過對各種菌產生膠原酶的研究，認為只有溶組織梭狀芽孢桿菌（Clostridum????histolyticum）與介毒無色桿菌（Achro-mobacter????iophagus）較有價值，在膠原酶的制備方面，美國哥倫比亞大學I.mandl博士提出的發酵配方提取方法及檢定方法至今仍為各國研究工作者采用。五十年代提純膠原酶的方法有四類：（1）硫酸銨沉淀法（2）有機溶劑沉淀分離法，（3）電泳法（4）吸附洗脫法。1959年，Grant.N.H.Alburn，H.z報導使用DEAE離子交換層析精制膠原酶的方法，七十年代至今采用的方法主要有兩類：（一）利用各種交換材料及分子篩進一步分離提純膠原酶（二）用親和層析提純膠原酶。

原工藝路線長，發酵液配方復雜。

本發明為了提高膠原酶的質量，改進了發酵液配方，改進了提取精制方法，提高收率。

本發明制備工藝為：

1.菌種Cl.histolyticum????64008。

2.培養基配方：酵母膏0.2-1%，酵母粉0.2-1%，明膠1%-3%，肉胨2%-6%。

3.發酵液培養溫度：37℃-42℃，周期為40-45小時，靜止發酵。

4.發酵液經無菌過濾后，在10℃以下，加硫酸銨沉淀膠原酶，使濃度達到45-55%（重量/體積）所獲沉淀溶于PH7-8，Tris-Ca⁺⁺緩沖液在低溫與氮氣加壓下經超濾膜脫鹽，冷凍干燥獲膠原酶粗品。

5.膠原酶粗品經以PH5-6，HAC-N_aAC緩沖液平衡之DEAE纖維素柱層析，下柱液再經PH6.0-7.5電導水平衡的SephadexG-25柱，獲得溶液經冰冷干燥即為膠原酶精制品，活力達到800-1000單位/毫克蛋白質。

實施例1、

菌種組織梭菌Cl.histolyticum64008

一級種液：酵母膏0.2%-1.0%，牛肉膏1%-2%，肉胨2%-6%，明膠1%-3%;二級種液：酵母膏0.2%-1.0%肉胨2%-6%，明膠1%-3%;接種量3%-5%，培養溫度37℃-42℃，周期24小時，發酵液：酵母膏0.2%-1%，酵母粉0.2%-1%，明膠1%-3%，肉胨2%-6%，PH7-8，溫度37℃-42℃，周期40-45小時，靜止發酵，發酵液效價在400單位/毫克，毒性安全劑量小白鼠尾靜脈注射50單位/只。發酵液經無菌過濾，泵壓至鹽水冷卻鍋，在低溫下加入硫酸銨使達50%濃度（重量/體積），再加入1%氯化鈣，放置過夜，收集硫酸銨沉淀，溶解于0.05克分子/Tris-Ca⁺⁺緩沖液，離心除雜質收集粗酶液，以超濾膜脫鹽，無菌過濾，冷凍干燥，得膠原酶粗品，較發酵液的比活力提高5-10倍，酶活性收率為50%。

例2：

以PH5-6的醋酸緩沖液平衡DEAE-Cellulose裝柱3.6×50厘米柱，進樣量控制在30萬-50萬單位，粗酶溶于醋酸緩沖液，上柱，收集膠原酶部份，再上Sephadex G-25柱（3.6×50厘米），以NaCL，NaoH調節水使電導達40-70微歐^-1，收集膠原酶部份，冷冰干燥，所獲得膠原酶精品純度可達800-1000單位/毫克蛋白質，每1200膠原酶單位中，蛋白酶含量低于10單位。

按本工藝制得的膠原酶，產品質量符合要求，制備的膠原酶試劑可供各研究單位分離細胞用，制備藥理規格的外用油膏制劑可用于治療清瘡脫痂，制備的注射劑可用于治療椎脊盤突出癥。