[其他]由培養(yǎng)液分離動物細胞的過程

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 85103552
• 申請日: 1985-05-04
• 公開（公告）號: CN85103552A
• 公開（公告）日: 1986-10-29
• 發(fā)明（設計）人: 肯尼
• 申請（專利權）人: 細胞技術有限公司
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 巫肖南,李雒英

本發(fā)明是關于由動物細胞培養(yǎng)液中分離出動物細胞和/或動物細胞碎片的過程，這過程最適合用于由培養(yǎng)液分離出雜種瘤。

分子生物學近年來的發(fā)展，導致了精細發(fā)酵方法和儀器的需求的增加，特別是人們對應用多種技術處理的動物細胞進行大量培養(yǎng)以便由這些細胞生產(chǎn)出多肽提取物和蛋白質，這過程的一個步驟，是要把動物細胞和/或動物細胞碎片，從培養(yǎng)液分離出來，這是從培養(yǎng)液分離出細胞產(chǎn)物的首要步驟。

傳統(tǒng)的分離方法，是把動物細胞用離心分離方法，從培養(yǎng)液分離出來。這方法通常效率低，因為要保證完全分離的話，就需要相對長的時間來獲得相當大加速度。另外一個辦法，就是過濾出培養(yǎng)液，但是這個做法，很容易使過濾器被動物細胞和細胞的殘片堵塞。所有兩種辦法，都可能丟除及帶走動物細胞及有用的細胞產(chǎn)物，并且沒法把細胞碎片和培養(yǎng)液上清液完全分離。

本發(fā)明的目的，提高由培養(yǎng)基分離動物細胞能力。

已經(jīng)知道的，絮凝微生物培養(yǎng)液，有助于由培養(yǎng)液分離微生物細胞;這種方法例子是把澄清劑加進不透明的愛爾啤酒內，澄清劑會使酵母菌和酵母菌碎片絮凝，最后沉淀在釀酒器的底部。

在一般情況下，動物細胞物質的表面，都帶有凈負電荷。由于靜電引力，不同極性的顆粒串接形成絮凝。我們可以相信，帶有正電荷的物質，會絮凝動物細胞和動物細胞碎片。很奇怪，我們發(fā)覺帶負電的溶化了的聚合物，對絮凝動物細胞和動物細胞碎片，竟然很有功效。此外，我們試驗了多種帶負電溶解的聚合物，只有一種顯示出有絮凝的極滿意效果，我們假定，這是由于聚合物表面上的電荷分布和細胞上的帶正電荷區(qū)域相互匹配所造成的。

按照本發(fā)明，我們提出一種把動物細胞和/或動物細胞碎片，從動物細胞培養(yǎng)液分離出來的方法必包括在培養(yǎng)液內混入多聚半乳糖醛酸，使動物細胞和/或動物細胞碎片絮凝，再從培養(yǎng)液分離出絮凝了的動物細胞和/或動物細胞碎片。

使用多聚半乳糖醛酸作絮凝劑，有多種好處。這些在物理分離前的動物細胞和/或動物細胞碎片的絮凝，可以顯著地增加產(chǎn)品產(chǎn)量，培養(yǎng)基的純度，及加快整體分離過程的速度。動物細胞碎片，由于它們的體積細小，很多時候都很難除去，但是使用本發(fā)明的話，就不但能夠絮凝動物細胞，還能夠絮凝動物細胞碎片。此外，使用本發(fā)明的工藝，只有少量的動物細胞由培養(yǎng)液的上清液中帶走。多聚半乳糖醛酸本身不含毒素，供應方便，價錢也便宜，它是由果膠脫酰得到的。

這多聚半乳糖醛酸可以是多聚半乳糖醛酸本身，或是任何能夠使動物細胞或動物細胞碎片絮凝的多聚半乳糖醛酸衍生物。如果多聚半乳糖醛酸是基本上溶于動物細胞培養(yǎng)液，它的分子量可以在一寬的范圍內變化。同樣地，多聚半乳糖醛酸的濃度通常也可以大范圍變化，而事實上因為這有效濃度是受到細胞密度的影響，所以多聚半乳糖醛酸的濃度是沒法準確劃定范圍。不過，可行的濃度上限由使細胞培養(yǎng)液變?yōu)槟z的多聚半乳糖醛酸濃度決定。這一點顯然是不理想。濃度的下限是由動物細胞或動物細胞碎片基本上開始絮凝的濃度來確定的。在一般的培養(yǎng)液內，多聚半乳糖醛酸濃度至少可以是0.004%（重量/體積），最好是大約0.03%。

動物細胞和/或動物細胞碎片隨重力沉淀后，可以使用過濾法或離心分離法，從液體分離絮凝了的動物細胞和/或動物細胞碎片。所獲得清澈上清液，再可進行純化，得到由動物細胞所產(chǎn)生的多肽或蛋質。上述的過程，當然可以用于那些例如聲波振動破壞了的細胞（在細胞培養(yǎng)液內）。

動物細胞，也許是在活體外生長的天然存在的動物細胞，不過，最好是一些遺傳變異了的動物細胞，理想的動物細胞，有雜種瘤細胞，例如是從家鼠或田鼠衍生的雜化種細胞，此外，這些動物細胞也可以是人的成淋巴瘤細胞，動物細胞產(chǎn)生抗體（IgM或IgG）的情況，在動物細胞和/或動物細胞碎片絮凝的過程中，只有少量抗體由培養(yǎng)基液中排出，因此大量抗體得保留下來。

絮凝時，理想培養(yǎng)液至少調整至酸性的PH值，因為酸性的PH值可確保細胞表面的氨基團和組氨酸殘馀物的質子化作用，由此增加了細胞上正電荷區(qū)域。低于PH3時，聚合物被電離;較好的PH值是PH4和PH7之間，PH值最好是在PH5和PH6之間。

培養(yǎng)液可以是任何合適培養(yǎng)基，例如是Dulbecco????Modified????Eagle????Medium（DMEM）或L-Broth。

用舉例方法來說明本發(fā)明。

例一

實驗實施將用來證明，是在培養(yǎng)液中產(chǎn)生抗體IgM的雜種瘤細胞的培養(yǎng)基上，大量帶負電可溶性聚合物的絮凝能力。這實驗的結果，著重說明多聚半乳糖醛酸在這方面的非凡特性。