[其他]L-肉毒堿的微生物學制備方法

無效

• 申請號: 85101191
• 申請日: 1985-04-01
• 公開（公告）號: CN1004146B
• 公開（公告）日: 1989-05-10
• 發明（設計）人: 漢斯·庫拉;帕維·萊何凱
• 申請（專利權）人: 隆扎股份公司
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠

以三甲銨丁烯內酯及／或γ－三甲銨丁內酯為原料，用微生物學方法制造Ｌ－肉毒堿。

人們已知，用γ-三甲銨丁內酯（γ-Buryrobetaine）作原料可以制造L-肉毒堿。有一種工藝方法是，在有2-氧代戊二酸鈉（Natrium-2-oxoglutarat）、還原劑、鐵離子源及作為羥基供給體的空氣氧存在下，使γ-三甲銨丁內酯與由粗糙鏈孢霉孢子（Sporen von Neurospora crassa）釋放出來的羥化酶相接觸（美國專利說明書第4371618號）。這種工藝方法的缺點是需要很多輔助因素。于是乎在反應中要使化學計算量的2-氧代戊酸鹽（2-oxoglutarat）用氧化法脫去羧基、生成丁二酸鹽（Succinat）。作為O₂的活化劑，需用Fe²⁺;為使鐵離子保持還原態，需用抗壞血酸;為分解有害的痕跡量H₂O₂，需用過氧化氫酶（Katalasc）。

林特施泰特（Lindstedt）等（Biochemistry 6，1262-1270（1967）“The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas）分離出一種以γ-三甲銨丁內酯為碳、氦來源而生長成的假單胞菌屬微生物。降解過程的第一步反應是將γ-三甲銨丁內酯經羥基化反應生成L-肉毒堿，并將中間存在的L-肉毒堿進一步完全分解代謝成CO₂、H₂O及NH₃。

即使利用這種由細菌制得的羥化酶（Hydroxyl-ase）來制造L-肉毒堿，也仍存在上述需要輔助因素的缺點（Lindstedt et al，Biochemistry 16，2181-2188（1977）“Purification and Properties of γ-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonassp.AK1”）。

本發明所賴以為基礎的任務是找出一種新的微生物，這種微生物不具有上述已知工藝方法的缺點，并使人們有可能使用簡單的方法以三甲銨丁烯內酯（Crotonobetain）、三甲銨丁內酯或其混合物為原料不制造外消旋鹽，而制造有拮抗選擇性的L-肉毒堿。

本發明的微生物不同于現有技術中已知系統的是，使用H₂O作為羥基供給體，而不使用O₂作為羥基供給體。這可以使用H¹⁸₂O及O¹⁸₂進行仔細的試驗來證實。

本發明所發現的微生物有能力以三甲銨丁烯內酯及/或γ-三甲銨丁內酯為原料來生產L-肉毒堿，而且不會將其分解代謝。

對取自四大州的土壤樣品進行了對比試驗，正如試驗結果所表明的那樣，到處都存在將三甲銨丁內酯和三甲銨丁烯內酯經由L-肉毒堿進行分解代謝的微生物。從廢水處理設備的加菌淤渣中也可以成功分離出這類微生物。如果將這類微生物按照下面所述的本發明原理進行誘變，則有可能將所有這類菌種用來生產L-肉毒堿。

這種誘變種可以通過下列選擇方法而得到：1）將以三甲銨乙內酯（Betain）、γ-三甲銨丁內酯、三甲銨丁烯內酯及L-肉毒堿為碳、氮來源生長的微生物用常規的方法進行誘變。2）從通過培養得到的已誘變的微生物培養物中選擇出那些不分解代謝L-肉毒堿而且不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內酯、γ-三甲銨丁內酯而僅依靠三甲銨乙內酯生長的穩定微生物。

最好在接著的選擇步驟2）之后選擇出那些分泌L-肉毒堿又不依靠L-肉毒堿、三甲銨丁烯內酯、γ-三甲銨丁內酯而僅依靠三甲銨乙內酯生長的微生物。

相應地將那些已誘變過的微生物在三甲銨乙內酯培養基中繼續培養并在進行選擇步驟2）之前，將這些已繼續培養過的微生物最好在L-肉毒堿培養基中繼續培養。培養以三甲銨乙內酯、γ-三甲銨丁內酯、三甲銨丁烯內酯及L-肉毒堿為碳、氮來源生長的菌種相宜地應這樣進行，即通過三甲胺銨丁烯內酯營養液接種使混合培養物由細菌混合物產生出來、然后借助傳統的微生物學技術再用該混合培養物作原料對那些能降解三甲銨丁烯內酯的微生物進行純培養。