[其他]牛焦蟲疫苗制造方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 85100848
• 申請(qǐng)日: 1985-04-01
• 公開（公告）號(hào): CN85100848B
• 公開（公告）日: 1987-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張中行
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): A61K39/018
• 分類號(hào): A61K39/018;C12N1/10
• 代理公司: 農(nóng)牧漁業(yè)部專利事務(wù)所
• 代理人: 陳如明

本發(fā)明涉及生產(chǎn)牛焦蟲疫苗的方法，特別是涉及 以高速轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)牛焦蟲疫苗的方法。

牛焦蟲病是一種寄生蟲病，主要分布在亞洲、非 洲、歐洲三十多個(gè)國家，世界上十億頭牛中，約有四分 之一的牛可能受到蜱的叮咬而受到血液原蟲的傳染， 每年因各種泰勒焦蟲病死亡數(shù)十萬頭，因此，牛焦蟲 病引?起了有關(guān)國家的高度重視。研究牛焦蟲疫苗較 早的國家有以色列、印度、土耳其，但它們都處于試驗(yàn) 室試驗(yàn)階段。檢索的蘇聯(lián)莫斯科庫茲明克獸醫(yī)試驗(yàn) 研究所在英國申請(qǐng)的專利(專利號(hào)2050161A，申請(qǐng) 日1979年6月4日，公布日1981年1月7日)，也處 于實(shí)驗(yàn)室靜止單層培養(yǎng)階段，由于數(shù)量質(zhì)量等原因不 能用于病區(qū)防疫。我國在牛焦蟲疫苗的研究方面，已 經(jīng)投入批量生產(chǎn)，廣泛用于牛焦蟲病的防預(yù)。國內(nèi)開 展這項(xiàng)研究工作較早的是中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究 所，其研究結(jié)果，在《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》1982年第四期 88-95頁上已發(fā)表。本發(fā)明人在中國農(nóng)科院蘭州 獸醫(yī)研究所的基礎(chǔ)上進(jìn)行了中間擴(kuò)大試驗(yàn)研究，把靜 止單層培養(yǎng)改為轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)，從而使牛環(huán)形泰勒焦蟲裂 殖體膠凍細(xì)胞疫苗的制造由實(shí)驗(yàn)室小批生產(chǎn)階段轉(zhuǎn) 入生藥廠大批生產(chǎn)階段。其靜止培養(yǎng)和低轉(zhuǎn)速培養(yǎng) (6周/小時(shí))生產(chǎn)過程中都是將懸浮細(xì)胞從培養(yǎng)瓶 倒入離心管內(nèi)離心后，倒掉清液，還要向培養(yǎng)瓶內(nèi)加 入細(xì)胞分散液(即威爾遜液)，振蕩培養(yǎng)瓶使貼壁細(xì)胞 全部脫落，再倒入另一離心管離心，去掉威爾遜液，把 兩次離心的沉淀細(xì)胞混合以這種方法收獲培養(yǎng)瓶上 的貼壁細(xì)胞，不僅要額外消耗許多化學(xué)藥品，而且為 了收獲貼壁細(xì)胞，還須投入較多人力，花費(fèi)許多時(shí) 間。并且威爾遜液對(duì)活細(xì)胞有破壞作用，隨著培養(yǎng)時(shí) 間增加將導(dǎo)致死亡細(xì)胞數(shù)增加，影響疫苗的質(zhì)量。

本發(fā)明就是為了解決培養(yǎng)細(xì)胞貼壁問題，使其增 殖細(xì)胞都懸浮于培養(yǎng)液中，以簡化收獲貼壁細(xì)胞的產(chǎn) 生過程，從而達(dá)到節(jié)省人力、時(shí)間、藥品，減少投資，降 低細(xì)胞死亡數(shù)的目的。

本發(fā)明的特征是在無菌的操作下，把種子細(xì)胞接 入培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)瓶于37℃溫室下放 置轉(zhuǎn)管機(jī)上轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶以每小時(shí)50至60轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 動(dòng)，培養(yǎng)120小時(shí)，繁殖一代，連傳十五代以上制苗， 其每代增殖細(xì)胞完全混合于懸浮液內(nèi)，大部分結(jié)為集 團(tuán)細(xì)胞，少數(shù)單細(xì)胞分散于懸浮液中。

本發(fā)明解決細(xì)胞貼壁問題是通過下列方式實(shí)現(xiàn) 的：

為了阻止或破壞細(xì)胞貼壁現(xiàn)象的發(fā)生，首先肯定 了不能用化學(xué)方法長時(shí)間脫壁，因化學(xué)藥品接觸活細(xì) 胞時(shí)間越長，對(duì)細(xì)胞破壞性越大，造成細(xì)胞死亡數(shù)增 加，實(shí)驗(yàn)證明：活細(xì)胞在威爾遜液內(nèi)70分鐘，活細(xì)胞 死亡2％，120分鐘，活細(xì)胞死亡60％，因此，發(fā)明人 采取了物理方式，即用改變培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)速度方式解決 細(xì)胞貼壁問題。基于這種設(shè)想，考慮到細(xì)胞培養(yǎng)瓶自 身旋轉(zhuǎn)的速度越快，則細(xì)胞停留在一個(gè)固定位置的時(shí) 間越短，則貼附于該處的機(jī)會(huì)和可能性就越小；當(dāng)轉(zhuǎn) 速達(dá)到某一速度時(shí)有可能出現(xiàn)細(xì)胞貼壁功能的受阻 或遭到破壞。因此，作了轉(zhuǎn)速與細(xì)胞貼壁率之間的關(guān) 系試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在表1中給出：

表1??轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)牛焦蟲疫苗所用轉(zhuǎn)速與細(xì)胞貼壁 率之間的關(guān)系

根據(jù)旋轉(zhuǎn)速度與細(xì)胞貼壁率的關(guān)系測定結(jié)果表 明：細(xì)胞培養(yǎng)瓶的旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到40周/小時(shí)時(shí)，細(xì) 胞貼壁率降為1％，旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到50周/小時(shí)，以 及速度超過50周/小時(shí)以上，細(xì)胞貼壁率皆為 0％固將阻止細(xì)胞貼壁現(xiàn)象產(chǎn)生最低轉(zhuǎn)速定為 50周/小時(shí)。

更有意義的是，在我們分析轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速與細(xì) 胞脫壁率的關(guān)系時(shí)，還研究了轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速與細(xì)胞 存活率的關(guān)系，其測定結(jié)果如表2所示

表2轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)牛焦蟲疫苗轉(zhuǎn)速與細(xì)胞存活率之 間的關(guān)系

根據(jù)表2所示結(jié)果可以看出，將靜止培養(yǎng)改為轉(zhuǎn) 動(dòng)培養(yǎng)，達(dá)到60周/小時(shí)轉(zhuǎn)速時(shí)并未出現(xiàn)活細(xì)胞死 亡現(xiàn)象，但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速時(shí)，細(xì)胞存活率開始下降，因 此，把轉(zhuǎn)速60周/小時(shí)確定為最適轉(zhuǎn)速的上限值。 觀察與分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)構(gòu)造、 體積、透明性、懸浮生產(chǎn)性能。含裂殖體百分率， pH變化以及疫苗的質(zhì)量、效力等方面，與靜止培養(yǎng) 沒有差異。