[其他]乙型肝炎診斷用e抗原(HBeAg)制備技術

無效

• 申請號: 85100276
• 申請日: 1985-04-01
• 公開（公告）號: CN85100276A
• 公開（公告）日: 1986-08-27
• 發明（設計）人: 王光榮;黃耀煊
• 申請（專利權）人: 軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29;C12N7/00;C12N15/00;//;C12R119)
• 代理公司: 59170部隊專利代理小組
• 代理人: 吳嘉善

本發明與一種乙型肝炎（以下簡稱乙肝）臨床診斷用。抗原（HBeAg）有關。

乙型病毒e抗原（HBeAg）是該病毒感染的主要血清學標志之一。目前用于乙肝臨床診斷和科學研究的e抗原制備的已有技術主要是從乙肝患者肝臟或從其血漿中提取。由于此方法大量生產e抗原受限制，不能滿足實際需要。

1981年以來，曾經利用大腸桿菌合成的c抗原（HBcAg）粗提物，進行抗原性轉化的研究結果，只能使部分的HBcAg轉化為HBeAg，例如英國的M_aC_kay等研究試驗了三個轉化方案：（1）以0.1%或0.5%鏈霉蛋白酶處理HB_cA_g;（2）以0.1%鏈霉蛋白酶+0.1%β巰基乙醇處理;（3）以0.1%SDS+0.1%β巰基乙醇處理等，結果發現0.1%鏈霉蛋白酶不能使HBcAg發生轉化，單獨用SDS或SDS+β巰基乙醇的結果，導致HBcAg活性全部破壞，鏈霉蛋白酶濃度增至0.5%時，HBcAg和HB_eA_g活性全部喪失。唯獨用0.1%鏈霉蛋白酶+0.1%β巰基乙醇于37℃下處理HBcAg，僅獲得部分HBcAg轉化為HBeAg。仍有相當一部分HBeAg未能轉化。因此，MaC_kay等的研究尚未制成可用于乙肝診斷的試劑。國內也未見有此類研究報道。

本發明與已有技術區別的要點在于首先利用DNA體外重組的遺傳工程原理建立了帶有HBcAg基因的重組克隆細胞系（株），證明該基因已能在大腸桿菌實驗菌株中表達，使之成為一種轉化e抗原的工程菌，再用0.2～2.0%β巰基乙醇對大腸桿菌合成的HBcAg處理2小時，獲得HBcAg全部轉化為HBeAg。解決了M_aC_kay等未能解決的問題，而且已試用于乙肝的臨床診斷。本發明提供的HBeAg和用人血漿提取的HBeAg同時用于免疫酶聯吸附試驗，共同對35份HBsAg反應陽性的乙肝患者血清標本進行對比試驗結果，兩者抗-HBe的符合率為91.4%。兩者呈直線回歸趨勢，求得的方程式為Y＝0.009+1.09X、相關系數r＝0.966。證明本發明提供的HBeAg和從人血漿提取的HBeAg兩者非常相關。本發明進一步和A_bbott-HB_e試劑盒對比測定相同血清標本結果，其符合率為100%。充分證明本技術方法及其提供的HB_eAg制品完全可以代替大量生產受限制的血漿提取HBeAg的方法及其制品。

發明的實施例

一、HBcAg的制備：

（1）工程菌在含有1%蛋白，0.5%牛肉浸膏，0.5%NaCl、PH7.3的培基中。37℃振蕩培養20小時;

（2）以5立升培養物低溫離心，收集菌細胞;

（3）用PH7.4????20mM磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌，并懸浮于200毫升溶菌緩沖液中（50mM葡萄糖，25mM，Tris-HCl，PH8，0.10mM????EDTA-2Na）;

（4）加入2毫升溶菌酶（25毫克/毫升），置4℃下1小時;

（5）加等體積予冷的PH8.0????25mM????EDTA-2Na。4℃冰箱過液;

（6）在Jc-2型超聲波破碎儀上間斷破碎菌體80分鐘;

（7）離心（25，000rPm/1小時），收集上清;

（8）于上清液中加硫酸至45%飽和度，使蛋白沉淀物，溶于PH7.2磷酸鹽緩沖生理鹽水中，最終體積為原培養物的1%;

（9）對此緩沖液進行透析，以除去硫酸銨后即為HBcAg粗提物。

二、HBeAg及抗-HBe檢測：

1.包被：在反應板各孔內加入包被用的抗-HBe????0.1毫升，4℃保溫24～48小時，洗板4次。

2.加樣：

（1）HBeAg檢測：

在反應板孔內加入檢樣血清0.1毫升，每塊反應板有陰、陽性對照及空白孔，43℃保溫1.5小時（或37℃保溫2小時），洗板4次），

（2）抗-HBe檢測：

在反應板孔內加入檢樣血清和中和試劑各50微升（μi），每塊反應板有陰、陽性對照（陰性對照是加入陰性對照血清及中和試劑各50微升;陽性對照是加入陽性對照血清及中和試劑各50微升）及空白孔，加完后在微型振蕩器上混勻1分鐘，43℃保溫1.5小時（或37℃保溫2小時），洗板4次。