[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因大豆事件JK1001-2及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310906946.3
• 申請(qǐng)日: 2023-07-24
• 公開（公告）號(hào): CN116656869B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂一帆;宋喻鑫睿;曹筠嵩;陳素妃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 捷康生物科技（海南）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京知匯林知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11794
• 代理人: 周敏毅

本發(fā)明提供一種核酸序列，其包含選自序列SEQ?ID?NO:1?7或其互補(bǔ)序列中的一種或多種，所述核酸序列來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件JK1001?2，包含所述事件的種子的代表性樣本已以保藏編號(hào)CCTCC?NO:P202333保藏。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大豆事件JK1001?2具有如下優(yōu)點(diǎn)：含人乳鐵蛋白基因并可穩(wěn)定表達(dá)人乳鐵蛋白；耐受常用商業(yè)化除草劑草甘膦；不降低大豆產(chǎn)量；能夠用分子標(biāo)記來追蹤繁殖群體及其子代中的轉(zhuǎn)基因插入片段。同時(shí)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的鑒定出來源于轉(zhuǎn)基因大豆事件JK1001?2植物材料的存在。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)方法，具體涉及含人乳鐵蛋白基因及對(duì)耐受草甘膦除草劑施用的轉(zhuǎn)基因大豆事件JK1001-2和用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆JK1001-2的核酸序列及方法。

背景技術(shù)

乳鐵蛋白是廣泛分布于具有分泌功能的組織及其分泌物中的蛋白，最早于1939年在牛奶中發(fā)現(xiàn)，并于1960年從牛奶和人乳汁中被分離。在人體中，初乳中含量最高，達(dá)8mg/ml，在乳汁中為1.5-4mg/ml,在淚液中為2mg/ml，在其他分泌物（如唾液、關(guān)節(jié)液、血漿）中含量較低，一般低于0.01mg/ml。其被認(rèn)為與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存相關(guān)，屬于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白（Lactotransferrin）家族。乳鐵蛋白序列在人、牛、鼠、豬等物種當(dāng)中高度保守，為約690個(gè)氨基酸殘基的糖蛋白，分子量約76-81kDa。在三維結(jié)構(gòu)上，乳鐵蛋白包含N-和C-兩個(gè)小葉（lobe），每個(gè)小葉在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的深裂隙中能夠結(jié)合一個(gè)單獨(dú)的Fe³⁺離子。

在消化道中，乳鐵蛋白會(huì)被水解成為具有生理功能的小肽——乳鐵蛋白活性多肽（LFcin?B），它是含有25個(gè)氨基酸的多肽，具有強(qiáng)堿性（pH8.15），其水溶液中呈親水脂的兩個(gè)反向β折疊結(jié)構(gòu)，具有耐熱、在消化道中不易降解、調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)、廣譜抑菌等特性。這也是口服乳鐵蛋白發(fā)揮活性的基礎(chǔ)。迄今為止，乳鐵蛋白的研究開發(fā)與應(yīng)用已成為科學(xué)研究的重點(diǎn)，現(xiàn)有研究表明，乳鐵蛋白具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨骼生成、調(diào)節(jié)腸道菌群等活性，其在疾病預(yù)防、輔助治療等方向上得到廣泛應(yīng)用。

目前乳鐵蛋白的制備主要依賴于從牛奶中提取，例如飛鶴集團(tuán)應(yīng)用先進(jìn)的層析超濾技術(shù),實(shí)現(xiàn)了乳鐵蛋白的提取，建成了行業(yè)內(nèi)第一條乳鐵蛋白自動(dòng)化生產(chǎn)線。然而從牛奶中提取乳鐵蛋白，具有動(dòng)物病原污染的風(fēng)險(xiǎn)，此外乳鐵蛋白的天然含量不足，約14kg牛奶中僅能提取1g蛋白，這都限制了從牛奶中大量制備乳鐵蛋白，也使得乳鐵蛋白的價(jià)格高達(dá)7000~8000元/kg。

為了大量生產(chǎn)乳鐵蛋白，目前，已經(jīng)有在大腸桿菌、畢赤酵母、小鼠、奶牛、馬鈴薯和大米中表達(dá)乳鐵蛋白的成功案例，然而通過原核生物表達(dá)的蛋白通常因?yàn)槿鄙俜g后修飾而不具有生物活性。以酵母或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)來表達(dá)這些蛋白不僅成本高而且條件要求高。

植物果實(shí)或種子具有較強(qiáng)的蛋白合成功能，若能以轉(zhuǎn)基因植物來表達(dá)乳鐵蛋白，其產(chǎn)物接近天然即具有較高的生物活性、表達(dá)量高、成本低而且簡(jiǎn)單易行。但是現(xiàn)有技術(shù)中很少有人利用植物尤其是大豆來大量生產(chǎn)乳鐵蛋白。

大豆(Glycine?max?(Linn.)?Merr.)在世界上很多地區(qū)都是重要的糧食作物及油料作物。生物技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于大豆以改善其農(nóng)藝性狀和品質(zhì)。在大豆生產(chǎn)中一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀是除草劑耐受性，特別是耐受草甘膦除草劑。大豆對(duì)草甘膦除草劑的耐受性可以通過轉(zhuǎn)基因的方法使草甘膦除草劑耐受型基因(epsps)在大豆植物中表達(dá)而獲得。