[發明專利]一株高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株、構建方法及應用在審
| 申請號： | 202310832456.3 | 申請日： | 2023-07-07 |
| 公開（公告）號： | CN116622535A | 公開（公告）日： | 2023-08-22 |
| 發明（設計）人： | 王敏;屠琳娜;楊春燕;喻雅琪;夏夢雷;申雁冰 | 申請（專利權）人： | 天津科技大學 |
| 主分類號： | C12N1/19 | 分類號： | C12N1/19;C12N15/31;C12N15/81;C07K14/395;C12P7/6481;C12P13/06;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N21/31;C12R1/865 |
| 代理公司： | 天津盛理知識產權代理有限公司 12209 | 代理人： | 韓曉梅 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 高產 磷脂 絲氨酸 釀酒 酵母 工程 菌株 構建 方法 應用 | ||
1.一株高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株，其特征在于：所述釀酒酵母工程菌株是在釀酒酵母宿主菌中過表達SEQ?ID?NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.根據權利要求1所述的高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在構建時采用表達載體pRS426，過表達SEQ?ID?NO.1所示的YML115C基因；
其中，所述釀酒酵母宿主菌為釀酒酵母菌株Saccharomyces?cerevisiae?BY4743。
3.如權利要求1或2所述的高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株的構建方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：
在釀酒酵母菌株Saccharomyces?cerevisiae?BY4743中過表達SEQ?ID?NO.1所示的YML115C基因。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于：具體步驟如下：
(1)根據SEQ?ID?NO.1所示的YML115C基因的核苷酸序列設計引物，構建帶有myc-HA標簽的YML115C基因過表達的重組質粒；
(2)對步驟(1)構建的重組質粒采用醋酸鋰轉化法導入釀酒酵母菌株Saccharomycescerevisiae?BY4743中進行表達；
(3)在尿嘧啶營養缺陷型固體培養基上進行篩選，在尿嘧啶營養缺陷型固體培養基上生長出的單菌落，即為高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：每1L尿嘧啶營養缺陷型固體培養基為：酵母氮源基礎6.5-7g/L，滅菌結束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，瓊脂2-3％，用ddH2O定容至1L；
其中，上述百分數均為質量濃度百分數。
6.如權利要求1或2所述的高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株在磷脂酰絲氨酸生產中的應用。
7.利用如權利要求1或2所述的釀酒酵母工程菌株發酵生產磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于：步驟如下：
將高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株通過三區劃線涂布于尿嘧啶營養缺陷型固體培養基平板上，25～30℃培養48-72h，將活化后的菌種，接1-2環于裝有3-5mL尿嘧啶營養缺陷型液體培養基中，25～30℃，180-220rpm條件下培養12-20h即為種子培養液，將種子培養液按2-15％接種量接入尿嘧啶營養缺陷型液體培養基中，25～30℃，180-220rpm條件下培養12-24h，即得。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：每1L尿嘧啶營養缺陷型固體培養基為：酵母氮源基礎6.5-7g/L，滅菌結束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物(DO?Supplement–Ura)0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，瓊脂2-3％，用ddH2O定容至1L；
每1L尿嘧啶營養缺陷型液體培養基為：酵母氮源基礎6.5-7g/L，滅菌結束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，用ddH2O定容至1L；
其中，上述百分數均為質量濃度百分數。
9.一種如權利要求1或2所述的高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株的細胞內的磷脂酰絲氨酸含量測定的方法，其特征在于：具體步驟如下：
(1)釀酒酵母工程菌株發酵結束后，收集全部菌體；
(2)將收集到的菌體進行冷凍干燥、破碎；
(3)使用有機溶劑萃取，合并溶劑層；
(4)使用有機溶劑萃取多次，合并溶劑層；
(5)氮氣吹干有機溶劑層，并復溶提取物質；
(6)使用UPLC/MS對所得到的物質進行檢測；
(7)計算細胞內磷脂酰絲氨酸含量。
10.一種如權利要求1或2所述的高產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株的生長曲線的測定方法，其特征在于：具體步驟如下：
(1)將產磷脂酰絲氨酸的釀酒酵母工程菌株和對照菌株即轉化含有pRS426的釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?BY4743分別接種于尿嘧啶營養缺陷型液體培養基的試管中，25～30℃，200～220rpm/min的條件下培養12-18h；
(2)分別取30μL、40μL、50μL菌液依次加入含有1mL尿嘧啶營養缺陷型液體培養基的EP管中，振蕩混勻，取200μL加入100孔板中，并且取200μL尿嘧啶營養缺陷型液體培養基作為對照；將100孔板放置于全自動生長曲線測定儀中，25～30℃培養，每隔1h測定波長600nm處的吸光度值；
(3)以培養時間X為橫坐標，OD600值Y為縱坐標，繪制生長曲線。
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