[發明專利]一種超聲渦旋振蕩聯合高效萃取枯草芽孢桿菌中七烯甲萘醌的方法

在審

• 申請號: 202310607043.5
• 申請日: 2023-05-26
• 公開（公告）號: CN116606200A
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 鄭之明;張瑞;丁秀敏;鄭文倩;王鵬;王晗;王麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C07C46/10
• 分類號: C07C46/10;C07C50/20
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種超聲渦旋振蕩聯合高效萃取枯草芽孢桿菌中七烯甲萘醌的方法，包括如下步驟：（1）向發酵液中加入正己烷、異丙醇混合液，先進行超聲波輔助萃取，劇烈旋渦振蕩，之后搖床萃取2?h；（2）在上述發酵液和有機溶劑混合液中加入正丁醇，劇烈振蕩,離心，收集有機相，得第一次萃取液；（3）重復步驟（2），得第二次萃取液，合并兩次萃取液，以0.22μm孔徑有機微孔濾膜過濾，即為發酵液中MK?7的提取液。本發明利用超聲波的破壁和促溶作用加上渦旋振蕩，使有機溶劑與發酵液充分接觸，使MK?7最終得率達到99.9%。本發明具有萃取得率高，無需干燥設備，步驟簡單，節約時間等優點，便于應用于工業化生產。

技術領域

本發明屬于維生素K₂提取分離技術領域，涉及一種超聲渦旋振蕩聯合高效萃取枯草芽孢桿菌中七烯甲萘醌的方法。

背景技術

維生素K₂(VitaminK₂，簡稱VK₂)是一種天然脂溶性維生素，化學結構式為2-甲基-3-烯基-1，4-萘醌，分子式為C₁₆H₁₆O₂·(C₅H₈)n，是一系列含有2-甲基-1，4-萘醌母核及C3位帶有數目不等的異戊二烯結構單元的萜烯側鏈化合物的統稱，根據異戊二烯側鏈數量的不同，維生素K₂可以分為14種，通常以MK-n表示，其中n指的是異戊二烯單元的個數。研究表明維生素K₂除了可以治療維生素MK-7缺乏性出血癥，促進凝血酶原的形成，加速凝血，維持正常的凝血時間，還能預防和治療骨質疏松癥。維生素K₂分子式如下：

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)是一種革蘭氏陽性菌，利用枯草芽孢桿菌發酵制備維生素K₂具有原料易得、條件溫和、能耗低、安全無毒等優點，而且通過微生物發酵制備的維生素K₂均為反式結構，具有更好的生物活性和生物相容性，易被人體吸收和利用。

維生素K₂是一種脂溶性維生素，現有技術大多采用有機溶劑從發酵液中提取維生素K₂，常用有機溶劑有乙醇、丙酮、石油氯仿等。例如中國專利CN104328064B使用正己烷、異丙醇等有機溶劑進行萃取，中國專利CN104262129B等利用柱層析設備，使用正己烷、石油醚、丙酮等試劑梯度或等度洗脫對發酵液中的維生素K₂進行分離提取。

根據文獻報道，目前用于分離提取枯草芽孢桿菌中維生素K₂的方法主要有以下兩種：1.固液萃取法：即將固體浸在特定的溶劑中，利用固體中各組分在溶劑中的不同溶解度，使固體中的有效成分從固相轉移到液相的過程。Sato等向含維生素K的發酵肉湯中加入丙醇：正己烷混合物(體積比1：2)，劇烈搖動混合物并靜置，分離有機層并蒸發，留下維生素K固體殘余物，之后用正己烷提取殘留物，離心后，使用甲苯：己烷混合物(體積比1：2)通過硅膠柱洗滌所得溶液。最后，通過HPLC分析組分并在真空下蒸發有機溶劑回收MK-7。Gao?Q等在對大腸桿菌MK-7生物合成系統進行優化時，在室溫下以13000rpm離心收集大腸桿菌細胞，并用蒸餾水洗滌一次，使用正己烷：2-丙醇(體積比2：1)浸提MK-7。2.液-液萃取法：指在液體混合物中加入與其不相混溶(或稍相混溶)的特定溶劑，利用其組分在溶劑中的不同溶解度而達到分離或提取目的。液-液萃取通常用于提取脂溶性代謝物。

徐行等直接在發酵液中加入異丙醇-正己烷(體積比1:2)，劇烈振蕩離心后，取上層有機相，重復萃取三次，得發酵液提取物。Berenjian?A等利用納豆芽孢桿菌生產MK-7時，在發酵液中加入異丙醇和正己烷的混合物，經劇烈振蕩離心后，使有機相和水相分層回收萃取MK-7。