[發明專利]一種對蝦急性肝胰腺壞死病恒溫熒光（RAA）快速檢測的引物探針組合、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202310569780.0
• 申請日: 2023-05-19
• 公開（公告）號: CN116656847A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 李家僑;張娜;謝艷輝;尹偉力;劉驍;劉葒;鄭樞;鄭曉聰;唐媛媛;斯澤恩;鄭舒尹;梁君妮;楊柏;楊金金
• 申請（專利權）人: 湛江海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6883;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

1.一種對蝦急性肝胰腺壞死病恒溫熒光(RAA)快速檢測的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包含了引物上游F、下游引物R和探針P組成，所述引物和探針為針對PVA1中的保守序列SEQ?ID?NO:4設計。

2.如權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述上游引物F為SEQ?ID?NO:1，下游引物R為SEQ?ID?NO:2，探針P為SEQ?ID?NO:3。

3.如權利要求1或2所述探針，其特征在于，所述的熒光探針采用熒光報告基團和熒光淬滅基團進行修飾，熒光報告基團修飾在探針序列離5，端堿基基數27bp的位置上；熒光淬滅基團修飾在探針序列離3，端堿基數16bp的位置上，熒光報告基團和淬滅基團之間間隔1個堿基，且探針的29位的A用四氫呋喃殘基替換。

4.如權利要求3所述的探針，其特征在于，所述的熒光報告基團為FAM；熒光淬滅基團為BHQ1。

5.一種對蝦急性肝胰腺壞死病恒溫熒光(RAA)快速檢測的試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒包含權利要求1-4任一項所述的引物和探針和其他RAA檢測試劑。

6.一種對蝦急性肝胰腺壞死病恒溫熒光(RAA)快速檢測的方法，其特征在于，所述方法用于非診斷目的，其包括如下步驟：

(1)提取待檢測對象的核酸樣品。

(2)試劑配制：

a.向裝有干粉酶制劑的檢測單元管中先加入25μLABuffer、2μL上游引物F(10μM)、2μL下游引物R(10μM)，0.6μLP探針(10uM)、12.9uL的水；

b.再向檢測單元管中加入5uL待檢DNA核酸；c.在檢測單元管蓋上加入2.5uL的BBuffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩充分混勻6次，隨后低速離心10sec。

(3)采用ABI熒光PCR儀，對參數進行設置，熒光通道選擇FAM通道，淬滅基團為None，反應程序為39℃60sec；39℃30sec，40個循環。

(4)結果判定：

陽性對照：有典型的擴增曲線出現，出鋒時間≤15min，為有效結果；

陰性對照：無擴增曲線出現，或出鋒時間≥20min，為有效結果；有典型的擴增曲線出現，出峰時間≤18min，判定為陽性；

無明顯擴增曲線，出峰時間＞18min，判定為陰性。