[發明專利]一種可高效羥化4-雄烯-3-酮系列化合物9α位的羥化酶及其應用

在審

• 申請號: 202310524115.X
• 申請日: 2023-05-10
• 公開（公告）號: CN116574702A
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 林芝;瞿旭東;林文緒
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/74;C12P33/06;C12R1/32;C12R1/19
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高效羥化4?雄烯?3?酮系列化合物9α位的羥化酶及其應用，所述羥化酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，所述羥化酶能夠生產9α?羥基?4?雄烯?3?酮類化合物。本發明的C9α羥化酶KshA底物識別寬泛，高產9α?羥基?4?雄烯?3?酮類化合物，純化過程不受還原組分KshB共表達的限制，可用于體外產生9α?羥基?4?雄烯?3?酮類化合物，本發明還提供了一株生產9α?羥基?4?雄烯?3，17?二酮的工程菌，其可轉化20g/L植物甾醇產生9.8g/L的9α?羥基?4?雄烯?3，17?二酮。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高效羥化4-雄烯-3-酮系列化合物9α位的羥化酶及其應用。

背景技術

甾體(Steroid)是一類以環戊烷多氫菲為母核的有機小分子，廣泛分布于自然界中。含氟甾體化合物作為甾體藥物家族的一個重要分支，大多為C9a位引入一個氟原子，如地塞米松、氟米松等，因氟原子的引入，使得其與靶蛋白結合的更加充分，生物活性和藥理活性得到了進一步地提高，臨床上被廣泛用于治療炎癥、過敏癥、自身免疫疾病中[Mills?JS,Bowers?A,Djerassi?C,et?al.Steroids?CXXXVII.1synthesis?of?a?newclass?ofpotent?cortical?hormones.6a,9a-difluoro-16a-hydroxypre-dnisoloneand?itsacetonide[J].Journal?of?the?American?Chemical?Society,1960,82(13):3399-3404]。由于甾體骨架十分惰性，在C9a位直接引入氟原子十分困難，工業上需要通過先在C9α位引入羥基，再經脫水形成C9和C11雙鍵，接著，雙鍵被環氧化，氟離子親核進攻C9位使得環氧開環形成。因此，甾體C9α位羥化，在含氟甾體藥物的制備中至關重要。

目前，在甾體骨架C9α位引入羥基很難通過化學合成方法實現，工業上主要依賴于微生物轉化的方法。常用的甾體C9α羥化工業菌株有結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、分枝桿菌(Mycobacterium)、紅球菌(Rhodococcus)等[Gibson?D?T,Wang?KC,Sih?C?J,et?al.Mechanisms?ofsteroid?oxidation?by?microorganisms.IX.On?themechanism?of?ring?a?cleavage?in?the?degradation?of9,10-seco?steroids?bymicroorgan-isms[J].Journal?of?Biological?Chemisiry,1996,241(3):551-559.]，相較于以4-雄烯-3，17-二酮為底物，微生物一步轉化植物甾醇更加方便，但天然菌株發酵過程中會受到自身羥化能力不足以及kstD還原基因的干擾，降解現象嚴重，副產物多，比如分枝桿菌Mycobacterium?NRRL?B-8119在產生9α-羥基-4-雄烯-3，17-二酮的同時會出現其他5種副產物[Wovcha?M?G.Process?for?Preparing?9α-Hydroxyandrostenedione:US,4035236[P].1997-07-12.]。2002年，Geize首次鑒定了紅球菌Rhodococcus?erythropolisstrain?SQ1中負責甾體C9α位羥化反應的關鍵酶[Geize?R?V,Hessels,G?I,Gerwen,R?V,etal.Molecular?and?functional?characterization?of?kshA?and?kshB,encoding?twocomponents?of3-ketosteroid?9α-hydroxylase,a?class?IA?monooxygenase,inRhodococcus?erythropolis?strain?SQ1[J].Mol.Microbiol.2002,45,1007-1018.]，接著，研究者們開始嘗試借助酶工程技術改造有甾體C9α位羥化活性的酶，期望獲得高效羥化甾體C9α位的重組菌株，然而到目前為止，改造后的菌株轉化過程仍然存在底物溶解度差、轉化能力不強等問題。2014年，華東理工魏東芝課題組對新金色分枝桿菌Mycobacteriumneoaurum?ATCC25795進行改造，將所有的kstD敲除，并過表達C9α羥化酶后，向重組菌株中投喂15g/L的甾醇可獲得7.33g/L的9α-羥基-4-雄烯-3，17-二酮，是目前報道的產量最高的水平，但仍伴有副產物4-雄烯-3，17-二酮的產生，很大程度可能是C9α羥化酶活性不足導致。