[發(fā)明專利]一種長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株及其制備方法和應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202310495340.5
• 申請日: 2023-05-05
• 公開（公告）號: CN116376722A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 王毅
• 申請（專利權）人: 云南省林業(yè)和草原科學院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;A61K36/06;A61P31/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京騰遠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11608
• 代理人: 王清娟

1.一株長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株，其特征在于：該菌株為長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048Dothichizasp.；保藏名稱為瘍殼孢屬；保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是中國武漢武漢大學；保藏日期：2021年11月1日；保藏編號:CCTCCM20211345。

2.根據(jù)權利要求1所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株，其特征在于：所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048的ITS基因序列為SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

3.根據(jù)權利要求1所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株，其特征在于：真菌在PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面呈絨毛狀，生長前期菌絲是白色呈放射狀向周圍生長，生長后期菌絲較密集，且菌層較厚，顏色微微泛紅，菌落呈規(guī)則的圓形狀。

4.權利要求1所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株制備的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌劑。

5.根據(jù)權利要求4所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌劑，其活性成分為如下(a)(b)(c)中的至少一種：

(a)權利要求1所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048的培養(yǎng)物的發(fā)酵液提取物；

(b)權利要求1所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048細胞的超聲裂解上清；

(c)權利要求1所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048細胞的超聲裂解沉淀。

6.權利要求1至5任一項所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取長松蘿樣品用無菌水沖洗干凈，在無菌環(huán)境下，用剪刀剪成0.5cm×0.5cm的小塊，先用1L無菌水沖洗樣品，再用75％乙醇消毒1min，期間不斷震蕩，后用無菌水沖洗3-4次，用無菌濾紙吸干樣品表面多余的水分，晾干備用；

(2)將處理好的樣品，放入2mL的離心管中，加入500μl的超純水，然后在細胞破碎勻漿機中180rpm震蕩2min破碎，將破碎液按十分之一、百分之一、千分之一進行稀釋，取200μl子實體懸浮液涂抹在PDAKAS抗細菌培養(yǎng)基上，PDAKAS抗細菌培養(yǎng)基：馬鈴薯200g/L+葡萄糖20g/L+瓊脂15g/L+氨芐青霉素50ug/mL+卡那霉素50ug/m，將接好的培養(yǎng)基放置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(3)取待培養(yǎng)基中長出的菌絲，在顯微鏡下把長出的菌絲轉接的到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，持續(xù)觀察10d后，將所挑取的菌株進行后續(xù)分子鑒定后得到長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌株。

7.權利要求5所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)加入1mL的PG液體到2mL的離心管中，并在每個離心管放3顆滅菌好的鋼珠，然后將已長成型的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌絲體刮取適量放入離心管，破碎90S，然后將破碎液分別接種500uL到每個裝有PG液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于28℃，轉速為150r·min^-1的搖床中培養(yǎng)10d；

(2)培養(yǎng)物菌絲體提取

發(fā)酵培養(yǎng)完成后，得到的真菌菌絲體及培養(yǎng)液，用分液漏斗將菌絲體和菌液分離，并在菌液中加入乙酸乙酯搖勻6min，菌液與乙酸乙酯的體積比為1：1，超聲30min后靜置12h，將分層的下層廢液回收，上層萃取溶液用旋轉蒸發(fā)儀冷凝回流干燥，獲得長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048培養(yǎng)的發(fā)酵液提取物。

8.根據(jù)權利要求7所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌劑的制備方法，其特征在于：所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為PG液體培養(yǎng)基。

9.根據(jù)權利要求8所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌劑的制備方法，其特征在于：所述的PG液體培養(yǎng)基由如下組分組成：馬鈴薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，維生素B₁0.1g/L，純凈水1L，培養(yǎng)基分裝至100mL錐形瓶。

10.權利要求4或5所述的長松蘿內(nèi)生真菌YAFEF048菌劑在制備抗細菌藥物中的應用。