[發(fā)明專利]具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f-12及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310495313.8
• 申請日: 2023-05-05
• 公開（公告）號: CN116478833A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝冰;胡浩洋;謝家偉;劉彥中;王慧明;楊景棟;彭小祠;孫晨;孟金朋;羅杰;楊皓若;杜江順;康樂怡
• 申請（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/04;C12Q1/6895;A24B15/20;C12R1/645
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f?12及其應(yīng)用；尼古丁是烤煙的重要化學(xué)成分，其含量高低與煙葉品質(zhì)及可用性關(guān)系十分密切。在我國烤煙主產(chǎn)區(qū)，尼古丁含量尤其是上部葉尼古丁含量偏高的問題十分突出，嚴(yán)重影響烤煙的銷售和開發(fā)，因此，適當(dāng)降低烤煙尼古丁含量勢在必行。本發(fā)明所提供的煙草內(nèi)生真菌能有效降解尼古丁，為烤煙生產(chǎn)提供新的應(yīng)用途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及煙草內(nèi)生菌領(lǐng)域，特別涉及具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f-12及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

煙草是我國重要的葉用經(jīng)濟作物，而尼古丁是煙葉中主要的生物堿，占總生物堿的95％，其含量與煙草的類型、農(nóng)業(yè)技術(shù)措施、調(diào)制方法以及自然條件等因素有關(guān)，同時，煙葉中尼古丁的含量與烤煙的品質(zhì)密切相關(guān)。

近年來，由于我國烤煙進行的打頂?shù)绒r(nóng)藝措施，煙株根系的尼古丁合成能力顯著提高，不同部位的煙葉尼古丁分配和積累迅速增加，尤其是上部煙葉的尼古丁含量偏高，這導(dǎo)致煙葉內(nèi)在化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性顯著下降，嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)及評吸質(zhì)量，煙葉的可用性降低。此外，近年來，降焦減害成為我國卷煙的重要趨勢，煙葉中的尼古丁是危害身體健康的重要因素之一，因此，降低煙葉中的尼古丁含量是煙葉生產(chǎn)過程中一個十分重要的環(huán)節(jié)，本發(fā)明提出的煙草品種云煙87中分離出的幾株內(nèi)生真菌能有效降解尼古丁。

在我們對云南煙草優(yōu)勢品種云煙87的內(nèi)生真菌菌群的研究中，共從田間采摘的云煙87煙株中分離出103株內(nèi)生真菌，共52種，隸屬于29個屬。其中，上部葉有10個屬共11種內(nèi)生真菌，中部葉有7個屬共8種內(nèi)生真菌，下部葉有6個屬共8種內(nèi)生真菌，莖部有9個屬共11種內(nèi)生真菌，粗根有12個屬共21種內(nèi)生真菌，須根有5個屬共7種內(nèi)生真菌。經(jīng)篩選，共有5種內(nèi)生真菌能降解尼古丁。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f-12及其應(yīng)用。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f-12，所述的煙草內(nèi)生真菌001f-12為：炭角菌屬001f-12，炭角菌屬(Xylaria.sp.)001f-12菌落呈白色，輻射匍匐生長，培養(yǎng)基表面菌絲生長緊密，菌落邊緣呈雪花狀；其由如下方法獲得：取田間自然生長的健康云煙87植株，分別對粗根、須根、莖、上部葉、中部葉、下部葉六個部位進行消毒，將煙草組織接種于固體培養(yǎng)基上，進行內(nèi)生真菌的培養(yǎng)得到。

進一步的，所述云煙87內(nèi)生真菌的培養(yǎng)方式，固體培養(yǎng)為：培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間5～7天；液體培養(yǎng)：將上述內(nèi)生真菌菌株接于液體培養(yǎng)基中，于搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速220rpm，培養(yǎng)時間48～72h。

進一步的，所述云煙87內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基，分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(46g/L)，121℃高壓蒸汽滅菌20min，加入鏈霉素(10mg/L)；液體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯(25g/L)，121℃高壓蒸汽滅菌20min，加入鏈霉素(10mg/L)。

進一步的，所述的液體培養(yǎng)基為，在液體培養(yǎng)基中加入尼古丁標(biāo)準(zhǔn)品，用于內(nèi)生真菌發(fā)酵。

進一步的，具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f-12鑒定方法為：用真菌通用引物ITS1/ITS4對菌株進行rDNAITS的PCR擴增，并對ITS?PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將所得序列在GenBank核算序列數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)測試菌株的ITS區(qū)域分別與已報道的尖孢鐮刀菌、Aspergillus?lentulus、土曲霉、Ovatosporabrasiliensi、Irpex?lacteus同源性最高，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，確定為炭角菌屬001f-12。

上述具有分解尼古丁能力的煙草內(nèi)生真菌001f-12在煙草尼古丁減少或分解方面的應(yīng)用。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：