[發明專利]一種保護劑及其在制備反轉錄PCR風干試劑中的應用

在審

• 申請號: 202310466338.5
• 申請日: 2023-04-26
• 公開（公告）號: CN116479100A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 蔣析文;胡飛馳;王麗芳;潘俊霞;黃妮
• 申請（專利權）人: 廣州達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種保護劑及其在制備反轉錄PCR風干試劑中的應用。所述保護劑包含20mg/mL～25mg/mL蔗糖、30mg/mL～40mg/mL海藻糖、2.5‰v/v～5‰v/v甲酰胺和1.5mg/mL～2.0mg/mL牛血清白蛋白。本發明提供的保護劑可以使反轉錄PCR預混體系在中高溫風干處理下依然維持穩定高效的檢測性能，適用于不同的檢測對象，與不同的引物和探針均可適配，能在常溫下長期保存以及運輸，為滿足常溫穩定的檢測需要提供了全新的解決方案。

技術領域

本發明涉及PCR技術領域，具體地，涉及一種保護劑及其在制備反轉錄PCR風干試劑中的應用。

背景技術

核酸分子診斷是體外診斷試劑領域的發展方向，尤其是實時熒光定量PCR技術廣泛應用于于病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達、突變及其多態性的研究等多個領域。實時熒光定量PCR技術，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，除了可進行定性檢測外，還可以通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

RT-PCR(Reverse?Transcription-Polymerase?Chain?Reaction)是將RNA的反轉錄(RT)和聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增合成目的片段。RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。

常規熒光PCR試劑中含有的引物探針、酶、buffer等組分，一般進行分裝保存，為確保試劑有效成分的生物活性，需要在-20℃左右的冷鏈環境中儲運及保存。多管分裝的熒光PCR試劑，在使用前需進行溶解配液操作，而反復開蓋增加體系污染的風險，另外冷鏈運輸不僅成本高，且環境溫度的變化造成試劑反復凍融會直接影響檢測試劑的性能和保質期。這既不能適用于冷鏈條件較差的基層醫療單位，也極大地增加了運輸成本。

目前市面上通過成熟的冷凍凍干技術，即一種向PCR反應試劑中添加凍干保護劑，將溶液在低溫下冷凍，然后將其固態直接升華為氣態的干燥方法。該方法可使PCR反應試劑由液體狀態轉變為凍干球固體狀態，使用前加入一定體積的液體復溶即可，既便于常溫運輸，又可避免試劑反復凍融造成性能降低的現象。通過冷凍凍干技術，雖可使PCR試劑在常溫條件下保持試劑性能穩定，但該凍干技術需要復雜的凍干工藝、昂貴的凍干設備以及較長的凍干時間。目前尚無簡便、環保且低廉的反轉錄PCR反應試劑的保存技術。

發明內容

為了解決現有技術中常規PCR試劑中反應體系每次使用都需現配現用，且無法常溫運輸的技術問題，針對現有PCR試劑凍干試劑需要復雜的凍干工藝、昂貴的凍干設備以及較長的凍干時間，成本較高的問題，本發明提供了一種保護劑及其在制備反轉錄PCR風干試劑中的應用。

本發明的第一個目的是提供一種風干試劑的保護劑。

本發明的第二個目的是提供上述保護劑在制備反轉錄PCR風干試劑中的應用。

本發明的第三個目的是提供一種反轉錄PCR風干試劑。

本發明的第四個目的是提供一種制備反轉錄PCR風干試劑的方法。

本發明的第五個目的是提供上述方法制得的反轉錄PCR風干試劑。

本發明的第六個目的是提供上述反轉錄PCR風干試劑在制備檢測試劑盒中的應用。

為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的：

本發明中所使用的保護劑組分主要為蔗糖、海藻糖、甲酰胺和BSA。本發明向PCR反應體系中添加保護劑，在風干干燥的過程中，含有保護劑的熒光PCR反應溶液保護劑在蛋白質周圍，使大分子蛋白質的鏈段運動受阻，阻止蛋白質的展開和沉淀，從而抑制了蛋白質結構亞能級與結構松弛之間的相互轉換，維持蛋白質分子三維結構的穩定性。