[發明專利]一種食淀粉乳桿菌胞外囊泡的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202310463422.1
• 申請日: 2023-04-26
• 公開（公告）號: CN116606766A
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 劉云歡;劉金燕;劉鮮姣;劉建新;劉丹丹;康瑋笠;李金燕;史夢蝶;王禹博
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K35/747;A61K47/46;A61P1/16;A61P29/00;C12R1/225
• 代理公司: 上海領譽知識產權代理有限公司 31383
• 代理人: 溫愛飛

本發明公開了一種食淀粉乳桿菌胞外囊泡的制備方法，其包括步驟：接種食淀粉乳桿菌進行培養，將發酵菌液離心，去除菌體沉淀，將上清液過濾，將得到的濾液使用高級離心管離心，將超濾液超速離心，將得到的沉淀重懸、過濾，獲得所述食淀粉乳桿菌胞外囊泡。上述制備方法或其制備的食淀粉乳桿菌胞外囊泡可應用于制備預防或治療膽汁淤積性肝病的制劑、制備胞外囊泡載藥系統等。本發明以食淀粉乳桿菌的生長曲線為切入點，以特定培養時間擴大菌體產量，結合超濾法濾過小分子蛋白等雜質，再以超速離心法分離出胞外囊泡，從而獲得高濃度的菌源胞外囊泡，提供了一種高效、高純度、低成本的胞外囊泡制備方法，且不會破壞囊泡結構。

技術領域

本發明涉及菌源胞外囊泡提取技術領域，尤其涉及一種食淀粉乳桿菌胞外囊泡的制備方法及其應用。

背景技術

乳酸菌作為微生態制劑的重要菌種，在維護人和動物腸道健康、促進體內微生態平衡方面起著重要的作用，大量研究表明，乳酸菌能夠調節機體胃腸道正常菌群、保持微生態平衡，提高食物消化率和生物價，降低血清膽固醇，控制機體內毒素，抑制腸道內腐敗菌生長繁殖和腐敗產物的產生，制造營養物質，刺激組織發育，從而對機體的營養狀態、生理功能、細胞感染、藥物效應、毒性反應、免疫反應、腫瘤發生、衰老過程和突然的應急反應等產生作用。食淀粉乳桿菌(Lactobacillus?amylovorus，La)是一類能夠水解淀粉的乳酸菌，Nakamura最初從牛場玉米的混合發酵物中和廢料發現并分離，并將其命名為食淀粉乳桿菌。之后研究人員從動物腸道中也成功分離出了食淀粉乳桿菌，該細菌屬于革蘭氏陽性菌，凸面，圓形，菌落呈白色，光滑，邊緣整齊不透明。鏡下呈鏈狀或單個，無芽孢，少數具有周毛，多數不運動，最適pH在5.5～6.0，但pH在3.0～4.5之間也能生存。食淀粉乳桿菌從口腔到達腸道，通過粘附、定植、繁殖形成穩定的菌群，維護腸道環境穩定和健康。食淀粉乳桿菌能夠產生抗生素物質，包括過氧化氫、有機酸，多肽和細菌素。

細菌可以主動釋放納米大小的膜囊泡到細胞外環境，這種20～400nm的球形結構被稱為胞外囊泡(Extracellularvesicles，EVs)。EVs可攜帶多種生物遺傳信息，例如核酸、酶、效應蛋白和毒力因子等，其結構使EVs在細菌競爭、生存、物質交換、宿主免疫逃逸、調節、感染和入侵中發揮重要作用。基于益生菌存在著許多對健康的促進作用，益生菌衍生的EVs表現出抗炎和抗腫瘤等有益作用，這些作用已在多項研究中得到明確證明。益生菌EVs可以攜帶細菌的生物活性成分，穿過粘液層直接遷移到其他組織或與宿主免疫系統的不同細胞相互作用，發揮其生物學功能。EVs可被視為益生菌發揮其有益效果的安全有效的通信媒介，因此益生菌衍生的EVs有望成為高效、安全性強、可應用于臨床實踐的生物制劑。胞外囊泡憑借其大小及雙分子膜等優勢在參與細胞間通訊、疾病診斷、疾病治療等方面發揮重要作用。近年來，使用EVs作為治療劑已經成為一個有前景的研究領域。與傳統的治療藥物(如小分子和抗體)相比，納米藥物(如EVs)的主要優勢在于納米顆粒的大尺寸能夠加入多種成分。例如，幾種藥物可以以最佳比例裝入同一個納米粒子，以達到提高療效的目的。

目前存在的分離胞外囊泡的方法主要有以下幾種：第一種方法是利用不同的超速離心速度或者是密度梯度離心：目前該方法是被認為是胞外囊泡分離的金標準，用此方法分離的胞外囊泡的純度高，但此方法提取出的胞外囊泡RNA含量非常低，且超速離心機價格昂貴無法普及，并且此方法提取的胞外囊泡結構可能被破壞；第二種方法是超濾法：此方法雖然操作簡單，但是得到的胞外囊泡的純度不高；第三種方法是商品化的試劑盒，此種方法，可以分為兩類：一類是將抽提試劑加入到樣品中，離心得到胞外囊泡的沉淀，另一類方法是將樣品加入到柱子中，在通過柱子的過程中，樣品中的蛋白質等雜質會進入到柱子中，而粒徑較大的胞外囊泡會先從柱子中流出，這樣能較快速的得到純度較高的胞外囊泡。對比這三種分離制備方法的優缺點，可以發現，使用密度梯度離心法分離制備的EVs雖然具有較高純度，但因其產量較低，通常不能用于常規研究。雖然可以在溫和條件下采用試劑盒法提取益生菌EVs，無需使用超速離心機，然而單次僅能提取少量菌液，且其中的步驟繁瑣。超速離心法是分離制備領域應用最廣泛的方法，在前期可通過差速離心、過濾等步驟除去菌體及其碎片、鞭毛等提高EVs純度。