[發明專利]一種新型耐低溫高堿性高效脫氮菌及其篩選方法、應用

在審

• 申請號: 202310457645.7
• 申請日: 2023-04-25
• 公開（公告）號: CN116622556A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 陳忱;劉百倉;王莉
• 申請（專利權）人: 海南立昇凈水科技實業有限公司;四川大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C02F3/34;C12R1/38;C02F101/16
• 代理公司: 成都華復知識產權代理有限公司 51298
• 代理人: 麥邁

1.一種新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株，其特征在于，名稱為反應假單胞菌(Pseudomonas?reactans)WL20-3，保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為WL20-3，其保藏號為：CGMCC?NO.25785。

2.根據權利要求1所述的一種新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株，其特征在于：所述菌株WL20-3能在(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂為唯一氮源的液體培養基上生長；且在營養瓊脂培養基上培養時，形成表面光滑濕潤、不透明、邊緣完整隆起呈現圓形的白色菌落。

3.根據權利要求1所述的一種新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株，其特征在于，其16SrRNA基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。

4.權利要求1所述新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法包括以下步驟：

a、菌株的富集與分離：取脫水污泥樣品于細菌富集培養基中，制備菌懸液；吸取菌懸液移至細菌富集培養基中，振蕩培養，為第一個富集培養周期，以此類推，進行多次富集培養；后稀釋液涂布于同時硝化反硝化培養基平板上，待平板上長出單菌落，挑取不同單菌落；

b、菌株純化：挑取步驟a單菌落并在LB培養基中純化2～3次；

c、異養硝化菌株的初步篩選：將上述純化菌株接入硝化培養基中，于4℃條件下進行硝化性能測試，采用氨氮分析測試盒進行顯色分析，挑選在4℃條件下脫氮性能較好的菌株；

d、好氧反硝化菌株的初步篩選：將步驟c中挑選的菌株接入到反硝化培養基中，于4℃條件下進行反硝化性能測試，采用陰離子色譜對溶液中硝酸鹽、亞硝酸鹽進行分析，從中挑選出在4℃條件下脫氮性能較好的菌株，該菌株為耐低溫異養硝化-好氧反硝化菌株；

e、低溫高堿性脫氮菌株復篩：將經過步驟d篩選的菌株接種于pH11.0的硝化培養基和反硝化培養基中，于4℃條件下培養，最終篩選到耐低溫高堿性異養硝化-好氧反硝化菌株。

5.根據權利要求4所述篩選方法，其特征在于所述培養基按下述比例配制：

LB培養基：5g/L酵母浸出粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉；

細菌富集培養基：5g/L葡萄糖，1g/L硝酸鈉，4g/L磷酸二氫鉀，6g/L磷酸氫二鉀，1g/L氯化鈉，0.2g/L硫酸鎂；

硝化反硝化培養基：0.078g/L硫酸氨，0.101g/L硝酸鈉，0.082g/L亞硝酸鈉2.81g/L六水琥珀酸鈉，0.2g/L七水硫酸鎂，1.50g/L磷酸二氫鉀，10.09g/L十二水磷酸氫二鈉，2mL微量元素溶液/L培養基；

硝化培養基：0.236g/L硫酸氨，2.81g/L六水琥珀酸鈉，0.2g/L七水硫酸鎂，1.5g/L磷酸二氫鉀，10.09g/L十二水磷酸氫二鈉，2mL微量元素溶液/L培養基；

反硝化培養基：0.303g/L硝酸鈉，2.81g/L六水琥珀酸鈉，0.2g/L七水硫酸鎂，1.5g/L磷酸二氫鉀，10.09g/L十二水磷酸氫二鈉，2mL微量元素溶液/1L培養基；

微量元素溶液：5g/L乙二胺四乙酸二鈉，3.92g/L七水硫酸鋅，5.50g/L氯化鈣，5.06g/L四水氯化錳，5.0g/L七水硫酸亞鐵，1.10g/L四水鉬酸氨，1.57g/L五水硫酸銅，1.61g/L六水氯化鈷。

6.采用權利要求1所述新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株制備的菌劑。

7.權利要求1所述新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株在脫氮技術領域中的應用。

8.根據權利要求7所述應用，其特征在于，所述新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株在溫度為3～35℃的水體中的脫氮應用。

9.根據權利要求7所述應用，其特征在于，所述新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株在pH值為7.0～11.0的水體中的脫氮應用。

10.根據權利要求7所述應用，其特征在于，所述新型耐低溫高堿性高效脫氮菌株用于脫除水體中的氨氮、硝態氮、亞硝態氮其中任意一種或多種。