[發(fā)明專利]一種桃實生種子的瞬時轉化方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310455023.0
• 申請日: 2023-04-25
• 公開（公告）號: CN116286967A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 程鈞;邵允;馮建燦;張郎郎;鄭先波;譚彬;王偉
• 申請（專利權）人: 河南農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/12;A01H5/10;A01H6/74
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種桃實生種子的瞬時轉化方法及其應用。以毛桃實生種子為侵染材料，將種子從桃核中取出，并于25℃清水中浸泡1?d；之后，去除種子胚根一端的種皮，并置于濕潤紗布上在25℃、遮光條件下進行種子萌發(fā)6?d，去除一片子葉后進行瞬時轉化。與現(xiàn)有桃瞬時轉化方法相比，本技術通過去除一片子葉后可有效提高轉化效率，且轉化效果維持時間長，可用于持續(xù)的熒光觀察。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種桃實生種子的瞬時轉化方法及其應用。

背景技術

桃是我國重要的經濟果樹，其果實味美多汁，深受消費者喜愛。隨著桃基因組測序工作的完成以及高通量測序技術的發(fā)展，為研究與農藝性狀和代謝途徑有關的候選基因提供了可能性。然而，由于缺少成熟的桃遺傳轉化技術，使得桃基因功能以及分子育種的相關研究嚴重地落后于其它果樹作物，如葡萄、蘋果、柑橘、梨等。因此，在穩(wěn)定轉化技術難題尚未被攻克的背景下，開發(fā)出桃瞬時轉化方法，具有重要研究意義。專利CN113717923A公開了利用山核桃原生質體制備瞬時轉化體系的方法，該方法是采用山核桃愈傷組織制備原生質體，然后針對原生質體進行瞬時轉化；專利CN112522306A公開了一種弱光處理顯著提高桃葉片瞬時轉化效率的方法，該方法利用桃葉在弱光處理的條件下進行瞬時轉化；現(xiàn)有的瞬時轉化方法，多是針對原生質體或愈傷組織的，在其它物種上有針對種子進行瞬時轉化的，但是由于桃核種子的結構，并且采用常規(guī)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)得毛桃種子胚芽的轉化率低。造成現(xiàn)在無法利用毛桃種子進行瞬時轉化。

發(fā)明內容

為解決上述技術問題，本發(fā)明提出一種桃實生種子的瞬時轉化方法及其應用。

本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：

一種桃實生種子的瞬時轉化方法，步驟如下：

（1）將種子從桃核中取出，于水中浸泡，然后去除種子胚根一端1/3的種皮，然后置于濕潤的紗布上進行遮光萌發(fā)；

（2）經步驟（1）處理后的種子去除一片子葉后，浸沒于含有重組載體的菌液中，進行真空侵染，然后將種子進行恒溫遮光培養(yǎng)，完成桃實生種子的瞬時轉化。

上述步驟（1）中水中浸泡的時間為24h。

上述，遮光萌發(fā)的溫度為25-29℃，時間為5-7天。

上述步驟（2）中經步驟（1）處理后的種子的胚根長度為0.8-1.2cm、胚芽呈現(xiàn)微綠色。

上述重組載體指含有GFP基因的重組載體，菌液為農桿菌菌液。

上述重組載體指將35S-GFP插入pSAK277載體獲得的重組載體，菌液為根癌農桿菌菌株?GV3101菌液。

上述真空侵染的壓強為0.09?Mpa，時間為25?min，恒溫遮光培養(yǎng)的溫度為28℃。

上述的瞬時轉化方法在培育轉基因植株中的應用。

上述轉基因植株指毛桃轉基因植株。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、針對現(xiàn)有的桃種子瞬時轉化效率低，本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)去掉一片子葉進行瞬時轉化的轉化效率是去除兩片子葉的12.8倍，去除一片子葉可顯著提高轉化效率（圖1），且不影響種子的正常生長。

2、與現(xiàn)有桃瞬時轉化方法相比，本方法操作簡單、植物材料無需無菌操作（現(xiàn)有的轉化方法是要求在無菌的條件下進行），利用本申請的方法可高效地將外源GFP基因轉入桃胚芽生長點中，且轉基因效果能持續(xù)9?d，遠高于現(xiàn)有的瞬時轉化效果維持時間。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。