[發明專利]一種噻蟲啉新型識別元件全長重組抗體制備及其在時間分辨熒光試紙條中的應用

在審

• 申請號: 202310443405.1
• 申請日: 2023-04-21
• 公開（公告）號: CN116535516A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 孫秀蘭;徐嘉;孫嘉笛;張銀志;紀劍;葉永麗
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C09K11/02;C07K14/77;C12N15/85;C12N5/071;G01N33/53;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種噻蟲啉新型識別元件全長重組抗體制備及其在時間分辨熒光試紙條中的應用，屬于分子生物學技術和時間分辨免疫分析快速檢測技術領域。本發明提供了一種噻蟲啉半抗原和完全抗原的制備方法以及噻蟲啉全長抗體重鏈和輕鏈的序列，抗體重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示；抗體輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。本發明試紙條檢測噻蟲啉的方法簡單快速，穩定可靠且靈敏度高，適合大量樣本的的篩查和現場監控，具有良好的商業化應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術和時間分辨免疫分析快速檢測技術領域，具體涉及一種噻蟲啉新型識別元件全長重組抗體制備及其在時間分辨熒光試紙條中的應用。

背景技術

新煙堿類殺蟲劑在世界范圍內廣泛使用，它們與昆蟲體內的煙堿乙酰膽堿受體結合，引起昆蟲異常興奮并通過抽搐性麻痹而死亡。新煙堿類殺蟲劑廣泛存在于土壤、自來水、水果、蔬菜和谷物中，極大地增加了人類污染的風險。接觸新煙堿類殺蟲劑會導致不良的健康影響，如癌癥、慢性病、出生缺陷和不孕不育。噻蟲啉(Thiacloprid,TCL)作為新煙堿類殺蟲劑的代表品種之一，是一種相對極性的農藥，更容易滲透到土壤深處，污染地下水，不可避免地進入食物鏈，對公眾健康構成威脅。目前,國內水果中的最大殘留限量(MRLs)為0.2-1mg/kg，蔬菜中的最大殘留限量為0.02-2mg/kg(GB?2763-2021)。因此，迫切需要建立一種快速、靈敏、準確的檢測方法。

食品樣品中的噻蟲啉殘留已經通過儀器方法，如色譜法和質譜法進行檢測。然而，這些方法需要昂貴的大型儀器和復雜的樣品制備過程，不適合現場快速檢測。免疫分析方法不需要昂貴的儀器，檢測成本低?？贵w是免疫分析的核心要素，負責識別分析物，抗體的特異性和靈敏度在免疫檢測中起著關鍵作用。目前市面上應用到免疫檢測中的抗體，主要是單克隆抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更好。但是由于動物免疫功能的復雜性，很難消除抗體的批間差異性?，F在亟需一種檢測噻蟲啉的重組抗體。

發明內容

本發明的目的是提供一種噻蟲啉半抗原、完全抗原、全長重組抗體的制備方法以及利用時間分辨熒光探針快速靈敏檢測噻蟲啉的免疫層析試紙條。本發明基于哺乳動物表達系統制備全長重組抗體，采用熒光微球替代傳統膠體金，用熒光微球與全長重組抗體偶聯制備熒光探針用于免疫層析，通過讀取熒光免疫分析儀上檢測線的熒光值，可以對果蔬樣品中的噻蟲啉進行快速定量分析。

本發明提供一種噻蟲啉半抗原，所述噻蟲啉半抗原的結構式如式I所示：

本發明提供一種上述的噻蟲啉半抗原的制備方法，將噻蟲啉原藥與巰基丙酸在堿性條件下進行取代反應，隨后進行酸化反應，分離純化后，即得式I所示噻蟲啉半抗原。

本發明提供一種噻蟲啉完全抗原，所述噻蟲啉完全抗原的結構式如式Ⅱ所示：

其中，protein為載體蛋白。

本發明提供一種上述的噻蟲啉完全抗原的制備方法，通過碳二亞胺法將式I與載體蛋白偶聯，得到所述噻蟲啉完全抗原。

一種噻蟲啉全長重組抗體，所述抗體重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示；所述抗體輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。所述抗體重鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示；所述抗體輕鏈恒定區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

在一種實施方式中，抗體重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，抗體輕鏈的可變區核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明一種含有編碼上述噻蟲啉全長重組抗體的基因的重組載體。

本發明一種攜帶上述的重組載體的細胞。