[發明專利]一種永生化綿羊皮膚成纖維細胞系及其培養方法與應用

在審

• 申請號: 202310435891.2
• 申請日: 2023-04-22
• 公開（公告）號: CN116590222A
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 潘春剛;宗樹成;劉昕澤;巴利民;潘文;張賀楠;王貴華;肖進
• 申請（專利權）人: 中牧實業股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳;張義成

1.一種綿羊皮膚成纖維細胞系，其特征在于，所述細胞系為綿羊胎兒皮膚成纖維細胞自然傳代獲得，命名為綿羊皮膚成纖維細胞LSF-2，該細胞系保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為：CGMCC?NO.23100。

2.權利要求1所述的綿羊皮膚成纖維細胞系在山羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CaPV)病毒的分離和/或培養中的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述山羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CaPV)病毒包括山羊痘病毒(Goatpox?virus,GPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox?virus,SPV)和牛結節性皮膚病病毒(Lumpy?skin?disease?virus,LSDV)。

4.權利要求1所述的綿羊皮膚成纖維細胞系的培養方法，其特征在于，使用完全培養基培養所述綿羊皮膚成纖維細胞系；所述完全培養基是DMEM/F12培養基中添加了新生牛血清(NBS)、氫化可得松和重組人堿性成纖維生長因子得到的培養基。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述完全培養基是DMEM/F12培養基中添加了質量百分濃度為4％的新生牛血清、1ug/ml氫化可得松以及10ng/ml重組人堿性成纖維生長因子的培養基。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在37℃、5％CO₂培養箱內，所述綿羊腎細胞系在細胞培養瓶中貼壁培養。

7.一種山羊痘病毒屬病毒的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)培養綿羊皮膚成纖維細胞系LSF-2長成致密單層后1:6的比例進行傳代；

2)培養24h后綿羊皮膚成纖維細胞系LSF-2長成單層細胞，棄去生長液，按培養體積的0.1％的接種量接種山羊痘病毒，無須吸附，直接加入細胞維持液置37℃溫室中繼續培養；所述細胞維持液為含質量百分濃度為2％小牛血清的DMEM/F12培養液，pH7.2；

3)培養96小時，此時細胞病變接近100％，反復凍融兩次，獲得病毒液；

所述綿羊皮膚成纖維細胞系LSF-2，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC?NO.23100。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟1)和步驟2)中，羊皮膚成纖維細胞系LSF-2的培養按照權利要求4-6中任意一項所述的方法培養。