[發明專利]一種卵巢癌培養基、類器官培養和傳代方法

在審

• 申請號: 202310433905.7
• 申請日: 2023-04-19
• 公開（公告）號: CN116496989A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 苗春光;王倩;許心悅
• 申請（專利權）人: 安徽駱華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 上海恩凡知識產權代理有限公司 31459
• 代理人: 吳堯曉

1.一種卵巢癌專用的類器官培養基，其特征在于，包含基礎培養基Advanced?DMEM/F12與以下濃度的組分：

1-5μM?Glutamax、

10-20μM?HEPES、

10-20μM?Nicotinamide、

100-200ng/ml?Noggin、

100-200nM?A83-01、

1-2mM?N-Acetylcysteine、

1-2％B-27、

100-200mg/ml?Rspo1、

10-20nM?Primocin、

5-10ng/ml?FGF-10、

10-20ng/ml?EGF、

30-40ng/ml?Heregulinβ-1、

5-10μM?Y-27632、

10-20μM?Forskolin、

1-2％penstrep、

400-500ng/ml?Hydrocortisone、

50-100nMβ-Estradiol、

20-30ng/ml?HGF、

20-30ng/ml?IGF-1、

20-50μg/ml?Insulin(Human)。

2.一種如權利要求1所述的培養基在培養人源卵巢癌類器官中的應用。

3.一種采用權利要求1所述的培養基培養卵巢癌類器官的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(一)將卵巢癌組織用提前預冷含有1-2％penstrep的DPBS溶液清洗后剪碎；

(二)使用含有基礎培養基Advanced?DMEM/F12和以下濃度成分：0.5-1mg/ml膠原酶Ⅱ、5-10μM?Y-27632、1-2％penstrep、1-5μM?Glutamax、10-20μM?HEPES配制而成的消化液進行37℃水浴震蕩分次消化；

(三)每消化30min，進行一次靜置，待較大組織塊自然沉降收集渾濁的消化液體上層，進行至少三次，期間可使用吹打幫助消化；

(四)將收集到的液體通過70μm的細胞篩過濾后放入4℃離心機200g離心，棄去上清；

(五)若出現肉眼可見的紅色沉淀則添加紅細胞裂解液2ml在室溫下裂解5min，再次4℃離心機200g離心，棄去上清，獲得卵巢癌細胞沉淀；

(六)加入適量的培養基重懸沉淀，進行臺盼藍計數，將上述步驟得到的卵巢癌細胞簇懸液以200-400個細胞簇/10ul基質膠(Matrigel)的密度接種于24孔板中，在37℃下倒置直至膠滴凝固；

(七)加入提前預熱的第一方面所述的卵巢癌類器官培養基后在37℃、5％CO₂的細胞培養箱中培養，每2-3天更換一次培養基，培養6-14天得到類器官。

4.一種采用權利要求1任一所述的培養基培養卵巢癌類器官的快速穩定傳代方法，其特征在于，具體步驟如下：

(一)收集培養成功的類器官膠滴，溶解膠質后用200g離心得到類器官沉淀；

(二)使用37℃預熱的胰酶室溫下消化1-5min，并用P1000移液管尖端嵌套P200移液管快速吹打破壞類器官結構；

(三)加10ml?DMEM/F12并用4℃離心機150g離心，收集類器官沉淀，用適量的培養基重懸，使用臺盼藍計數；

(四)上述步驟得到的卵巢癌細胞簇懸液以200-400個細胞簇/10ul基質膠(Matrigel)的密度接種于新的24孔板中，在37℃細胞培養箱中倒置直至膠滴凝固；

(五)加入提前預熱的第一方面所述的卵巢癌類器官培養基后在37℃、5％CO₂的細胞培養箱中培養，每2-3天更換一次培養基，培養6-14天得到傳代類器官。