[發(fā)明專利]一種環(huán)境介質中新冠病毒的可視化快速檢測方法

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• 申請日: 2023-04-21
• 公開（公告）號: CN116536452A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設計）人: 蘇高星;徐宇航;劉寅;于艷艷;趙林霞;沈凌波;楊揚
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于環(huán)境介質中新冠病毒的可視化快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.核酸提取：對環(huán)境采樣進行處理，得到核酸提取溶液；

S2.一管法反應：在試管底部加入A組分、10×RPA-Cas緩沖液、100μM的G4鏈、100μM的Hemin、無酶水和15％葡萄糖，然后將B組分、所述核酸提取溶液和280mM的MgOAc混勻后，加入試管底部溶液上方，不混合，35-41℃孵育20min，得檢測試劑；

其中，A組分含有Cas12a和crRNA，B組分為RT-RPA混合物，G4鏈的序列如SEQNO.1所示；

S3.向所述檢測試劑中加入顯色試劑，室溫條件下2-7min后，讀取吸光度，根據(jù)所述吸光度檢測新冠病毒。

2.根據(jù)權利要求1所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，所述對環(huán)境采樣后進行處理，具體為：將采樣棉簽放于環(huán)境采樣的采樣液中，1MHCl溶液與所述采樣液按比例1:10混合，處理2-7min后，加入與HCl等濃度等量的NaOH溶液，進行中和，中和后，得到核酸提取溶液。

3.根據(jù)權利要求1所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，RPA-Cas緩沖液為：NaCl的濃度為50mM，Tris-HCl的濃度為10mM，MgCl₂的濃度為10mM，BSA的濃度為10μg/mL，pH為7.9。

4.根據(jù)權利要求3所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，A組分的配置方法為：4μL1μM的Cas12a，4μL1μM的crRNA以及0.8μL10×RPA-Cas混勻，37℃孵育10min，冷凍保存。

5.根據(jù)權利要求4所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，B組分的配置方法為：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化緩沖液，2.4μL10μM的正引物，2.4μL10μM的反引物，1μL200U/μL的逆轉錄酶和2μL40U/μL的RNase抑制劑，混勻，配制好RT-RPA混合物。

6.根據(jù)權利要求5所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，所述一管法反應具體為：在試管底部加入8.8μL的A組分、1.2μL的10×RPA-Cas緩沖液、1μL的100μM的G4鏈、100μM的Hemin、無酶水和15％葡萄糖，總體積為20μL，然后將6μL的B組分、4μL的所述核酸提取溶液和1μL的濃度為280mM的MgOAc混勻后，加入試管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min，得檢測試劑。

7.根據(jù)權利要求1所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，所述顯色試劑由8μL10×RPA-Cas緩沖液、60μL水、10μL60mMABTS鹽、0.5μL1MHCl和0.5μL1MH₂O₂配置而成。

8.根據(jù)權利要求1所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，所述讀取吸光度為酶標儀測量吸光度。

9.根據(jù)權利要求1-8任一項所述的可視化快速檢測方法，其特征在于，所述檢測的檢測下限為0.84copy/μL。