[發(fā)明專利]一種高純度NK細胞庫構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310431278.3
• 申請日: 2023-04-21
• 公開（公告）號: CN116458494A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂學燕;王靜宜;黃園園;楊月峰;王立燕;郭雷鳴
• 申請（專利權(quán)）人: 北京景達生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C40B50/06;C40B40/00;A61K35/17;A61K45/06;A61P31/12;A61P35/00;A61P35/02;A61P37/02;A61P3/10;A61P1/16;A61P1/04;A61P17/00;A61P7/06
• 代理公司: 北京預立生科知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11736
• 代理人: 高倩倩

本發(fā)明提供了一種高純度NK細胞庫構(gòu)建方法，所述的方法包括NK細胞的體外擴增、NK細胞磁珠分選、NK細胞的凍存、NK細胞凍存后擴增培養(yǎng)。本發(fā)明的技術(shù)方案增強了NK細胞復蘇后再次擴增能力，具有應用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高純度NK細胞庫構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

人自然殺傷細胞(NK)占所有循環(huán)淋巴細胞的15％。NK細胞發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細胞有關(guān)。NK細胞表現(xiàn)出抗腫瘤細胞毒性，無需事先致敏和產(chǎn)生細胞因子以及調(diào)節(jié)各種免疫反應的趨化因子。人外周血NK細胞可分為CD3-CD56bright和CD3-CD56dim兩大類。CD56bright?NK細胞通常被認為是低細胞毒性的細胞因子產(chǎn)生細胞，而CD56dim?NK細胞則具有潛在的細胞毒性。由于NK細胞能夠識別和分解腫瘤細胞，以NK細胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個激動人心的關(guān)頭。

雖然NK細胞在臨床應用上的安全性和療效得到肯定，但由于它僅占外周血淋巴細胞的5％-15％，當罹患腫瘤時，大多數(shù)腫瘤患者存在體內(nèi)NK細胞數(shù)量下降和/或NK細胞清除癌細胞的能力下降的問題，導致自身的NK細胞分身乏術(shù)難以對抗激增的腫瘤細胞，而此時從患者外周血中分離自體NK細胞擴大培養(yǎng)進行過繼免疫治療也難以取得令人滿意的效果，這些都為NK細胞的臨床應用設(shè)置了障礙。NK細胞本身無MHC限制，異體使用不會產(chǎn)生GVHD。但T、B等其他免疫細胞可引發(fā)GVHD以及宿主抗移植物等反應。因此，高純度NK細胞的制備就至關(guān)重要。免疫磁珠做細胞分選是高效簡捷的免疫細胞的分離純化方法，MACS(magnetic-activated?cell?sorting)分選是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在分選柱內(nèi)，而無該種表面抗原的細胞由于不能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合而沒有磁性，不在分選柱內(nèi)停留，進而使細胞得以分離。MACS微珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順磁化微粒，磁珠陰性分選可通過微珠標記需要去除的雜細胞，得到高純度的目的細胞。

為了便于人們有效儲存和使用組織和細胞資源，目前在世界范圍內(nèi)已經(jīng)有多種細胞庫或者組織庫建立，如臍血造血干細胞庫，間充質(zhì)干細胞庫等。建立外周血來源NK細胞庫，一方面可以通過多輪擴增提升NK細胞擴增倍數(shù)；另一方面，NK細胞庫為KIR和HLA配型提供了方便，使得病人可以用到最佳的NK細胞。

NK細胞的增殖潛力有限，體外擴增是一項挑戰(zhàn)。近年來對NK細胞擴增培養(yǎng)的研究一般采用添加滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法和純因子培養(yǎng)法兩種方案。添加滋養(yǎng)層細胞能使NK細胞較好地被激活并大量擴增，但是添加的滋養(yǎng)層細胞即使經(jīng)過了輻照也仍存在很大的風險，不適合應用于臨床；使用純因子法誘導擴增PBMC中的NK細胞更安全、適用于臨床，但擴增倍數(shù)一般不理想，另外，異體NK細胞的回輸需要完全清除T細胞，以避免GVHD；想要用純因子法大量擴增并獲得純度大于99％的高活性NK細胞，這無疑是一項極其艱巨的任務(wù)。

外周血來源的終末分化NK細胞對于凍存高度敏感，現(xiàn)有的商品化凍存液凍存的NK細胞，按照常規(guī)培養(yǎng)手段進行培養(yǎng)，再次擴增能力弱。使得NK細胞庫的建立面臨巨大挑戰(zhàn)。

參考文獻：

1.CAR-expressing?NK?cells?for?cancer?therapy:a?newhope.BiosciTrends.2020?Sep?6.

2.Beatriz?Cózar?et?al，Tumor-infiltrating?natural?killer?cells，CancerDiscov.2021?January?01；11(1):34–44.