[發(fā)明專(zhuān)利]兒茶酚胺代謝物的提取和檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310419250.8
• 申請(qǐng)日: 2023-04-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116399971A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊雪瑩;申業(yè)明;劉亞娟;趙高嶺;陳靜;蔡克亞;吳學(xué)煒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/72;G01N30/04
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及兒茶酚胺代謝物的提取和檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了兒茶酚胺代謝物的提取和檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，所述試劑盒中包括了可直接利用的磁懸液、淋洗液和洗脫液；將所述磁懸液用于樣本中兒茶酚胺代謝物的提取，操作簡(jiǎn)單直接，使用前不需要通過(guò)活化、平衡；且本發(fā)明對(duì)樣品前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，避免了蛋白沉淀的發(fā)生，處理步驟更加簡(jiǎn)單快速，更有利于臨床樣本中兒茶酚胺代謝物濃度的檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及兒茶酚胺代謝物的提取和檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)為一類(lèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)或激素物質(zhì)，是正常生理過(guò)程中重要的信號(hào)介質(zhì)，同時(shí)在病理過(guò)程中也出現(xiàn)其含量的相應(yīng)變化。兒茶酚胺原型主要為腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)，其代謝物分別為變腎上腺素(MN)、去甲變腎上腺素(NMN)和3-甲氧酪胺(3-MT)。兒茶酚胺代謝物與原型物質(zhì)相比，其半衰期更長(zhǎng)，其性能更加穩(wěn)定。

目前常見(jiàn)的測(cè)定血漿中兒茶酚胺代謝物的金標(biāo)準(zhǔn)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其前處理方式主要有固相萃取法、磁珠法。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的定量檢測(cè)能力，常用的串聯(lián)質(zhì)譜為三重四極桿。其檢測(cè)原理為流動(dòng)相攜帶待測(cè)物流經(jīng)色譜柱，經(jīng)色譜柱分離后，流出的物質(zhì)先后在離子源內(nèi)形成帶電離子，經(jīng)過(guò)四極桿的篩選后最終測(cè)定物質(zhì)對(duì)應(yīng)的m/z實(shí)現(xiàn)定量分析。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的是物質(zhì)本身，因此具有更高的特異性和靈敏度，分析時(shí)長(zhǎng)更短，但是對(duì)樣本的前處理過(guò)程要求較高。

固相萃取原理是樣品基質(zhì)各組分在萃取小柱或萃取板上的保留能力不同，使目標(biāo)分析物保留并洗脫下來(lái)，同時(shí)去除樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)(干擾物)，分析物被濃縮。由于是特定性的選擇對(duì)應(yīng)的固相萃取小柱或萃取板，其凈化程度非常之高，且減少了基質(zhì)效應(yīng)。但是這種方法前處理操作也比較復(fù)雜，且固相萃取板成本較高，另外通常需要借助于正壓或負(fù)壓以及氮吹裝置，較難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

磁珠法是近幾年較為熱門(mén)的前處理方法，在臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用包括核酸如RNA、DNA、mRNA的擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)、質(zhì)譜分析法以及蛋白質(zhì)的電/化學(xué)發(fā)光測(cè)定等。其原理是指是運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良修飾后，制備成超順磁性微球，該微球表面加以修飾的相應(yīng)功能基團(tuán)能與目標(biāo)分析物特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。現(xiàn)有磁珠法試劑盒的缺點(diǎn)：試劑盒在使用前，磁珠需要先活化、平衡，導(dǎo)致樣本前處理周期長(zhǎng)；前處理淋洗過(guò)程中有機(jī)試劑的加入與殘留的樣本有發(fā)生蛋白沉淀的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供兒茶酚胺代謝物的提取和檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供了提取和檢測(cè)兒茶酚胺代謝物的試劑盒，其包括淋洗液、洗脫液和磁懸液，

所述洗脫液為甲酸和乙腈的混合液；

所述磁懸液的制備方法為：利用有機(jī)溶劑處理磁珠后，以磷酸鹽緩沖液重懸，制得所述磁懸液；

所述有機(jī)溶劑包括甲醇和乙腈的混合液、甲醇或乙腈中的任意一種。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的試劑盒中，

所述淋洗液為甲醇溶液；

所述洗脫液中，甲酸的體積占比為0.2％～10％，優(yōu)選為1％～5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％)，當(dāng)甲酸體積占比過(guò)高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生比較嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，影響后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)的圖譜峰形，在本發(fā)明中，優(yōu)選的，甲酸和乙腈的體積比為2:98；

所述磁懸液中磁珠的濃度為5mg/mL；

所述磁懸液中的磁珠為羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒徑為30～50μm；該款磁珠粒徑較大，便于后續(xù)磁吸過(guò)程中充分磁吸集中，避免在上清液中殘留磁珠而堵塞色譜柱，影響后續(xù)色譜柱性能；