[發明專利]合成麥角硫因的解脂亞洛酵母菌株及其應用

在審

• 申請號: 202310413556.2
• 申請日: 2023-04-18
• 公開（公告）號: CN116396878A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 周景文;劉孟粟;陳堅;曾偉主;胡淋鋒
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/60;C12N15/53;C12N15/52;C12P13/04;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了合成麥角硫因的解脂亞洛酵母菌株及其應用，屬于基因工程和生物工程技術領域。本發明通過在解脂亞洛酵母中表達Trichoderma?parareesei來源的TrEGT1和TrEGT2，實現了麥角硫因的異源合成。通過篩選不同的啟動子驅動TrEGT1和TrEGT2，獲得了最佳的麥角硫因合成基因組合。進一步將基因組合多拷貝整合，并通過前體組氨酸的合成強化，提高了解脂亞洛酵母合成麥角硫因的能力，使搖瓶發酵產量達到1200±12.3mg/L，5L發酵罐上發酵產量達到8.6g/L。本發明將異源代謝途徑整合到解脂亞洛酵母實現了麥角硫因的高效率生產，有助于實現低成本規模化生產麥角硫因及其產品。

技術領域

本發明涉及合成麥角硫因的解脂亞洛酵母菌株及其應用，屬于基因工程及生物工程技術領域。

背景技術

麥角硫因(ERG)是一種含硫醇的組氨酸衍生物，可保護細胞免受過量活性氧(ROS)引起的氧化損傷。ERG主要存在于生理pH條件下的硫酮互變異構體中，具有相對較高的還原電位(-60mV)，使其相比其他含硫醇的抗氧化劑(如谷胱甘肽)更穩定且更耐自氧化。作為一種強大的抗氧化劑和細胞保護劑，ERG被認為對人體健康具有有益作用，如抗炎、抗衰老、抗抑郁特性和防止紫外線損傷的能力。最近，ERG已被評估為食品和化妝品等添加原料，這將增加ERG的市場需求和ERG生產方法的探索。ERG普遍存在于高等生物中，如植物和哺乳動物中，但是，它僅由細菌和真菌生物合成，如藍細菌、放線菌和擔子菌蘑菇等。對人類來說，ERG的主要飲食來源是蘑菇。研究表明，食用蘑菇可以降低認知功能性疾病和癌癥風險。由于ERG的抗氧化，推測ERG是導致這種效應的化合物。在具有人類β-淀粉樣蛋白積累的阿爾茨海默病轉基因秀麗隱桿線蟲模型中，ERG被證明可以改善健康和壽命。

因此，ERG是健康老齡化新膳食補充劑的主要候選者。目前，只有化學合成的ERG在市場上銷售。然而，維生素或營養保健品化學合成過程中的有毒副產物會引起消費安全問題，并且嚴格的純化過程加劇了生產成本。相比之下，微生物發酵法合成麥角硫因更具加綠色環保優勢。

麥角硫因由前體組氨酸、半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸生物合成。在真菌途徑中，組氨酸被Egt1甲基化三次，形成組氨酸三甲基內鹽，隨后，Egt1酶連接半胱氨酸生成環己基半胱氨酸亞砜，再由環己基半胱氨酸亞砜裂解酶Egt2將丙酮酸銨從中間體中解離，最后硫還原產生ERG。在細菌中合成麥角硫因的步驟較為復雜，細菌途徑的缺點是使用五種酶而不是兩種，并且ATP用于形成包括谷氨酸的其他途徑中間體，谷氨酸必須在后續的步驟中被切割掉。此外，大腸桿菌作為致病性微生物，無法用于食品、藥品等相關領域的生產。通過在微生物宿主中表達麥角硫因合成途徑，已經實現了麥角硫因的從頭合成，但是產量較低，對于工業化規模生產較為困難。解脂亞洛酵母作為一種典型的非常規產油酵母，是國際公認的安全可靠的微生物生產宿主，有著完整的遺傳操作工具，并且還具有強大的還原系統，是理想的麥角硫因生產宿主。

發明內容

本發明提供了一種合成麥角硫因的解脂亞洛酵母工程菌，在出發菌株中表達來源于Trichoderma?parareesei的麥角硫因合成蛋白1TrEGT1，并表達來源于Trichodermaparareesei的環己基半胱氨酸亞砜裂解酶TrEGT2。

在一種實施方式中，所述麥角硫因合成蛋白1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述環己基半胱氨酸亞砜裂解酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

在一種實施方式中，所述出發菌株為解脂亞洛酵母Po1f，公開于論文《Combining26srDNA?and?the?Cre-loxP?System?for?Iterative?Gene?Integration?and?EfficientMarker?Curation?in?Yarrowia?lipolytica》。

在一種實施方式中，所述解脂亞洛酵母以解脂亞洛酵母Po1f，解脂亞洛酵母E129，解脂亞洛酵母E150，解脂亞洛酵母Po1d，解脂亞洛酵母Po1g或解脂亞洛酵母Po1h為出發菌株。