[發明專利]一種絲狀真菌通用CRISPR/Cas9編輯系統及其構建方法

在審

• 申請號: 202310403822.3
• 申請日: 2023-04-17
• 公開（公告）號: CN116555316A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 黃和;施天穹;郭琪;張馳;徐晴
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/66;C12R1/685;C12R1/68;C12R1/645
• 代理公司: 西安杜諾匠心專利代理事務所(普通合伙) 61272
• 代理人: 蘇雪雪

1.一種絲狀真菌通用CRISPR/Cas9編輯系統的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

獲取絲狀真菌H2B定位信號和5sRNA啟動子的核苷酸序列；

將絲狀真菌H2B作為模板設計引物FFH2B-F和FFH2B-R，并PCR擴增出帶有同源臂的FFH2B表達框之后，利用內切酶SpeI將模板質粒pUC-Cas9-HPH酶切成線性片段，并將線性片段與所述帶有同源臂的FFH2B表達框進行克隆和測序驗證，獲得重組質粒pUC-Cas9-HPH-FFH2B，其中，所述模板質粒pUC-Cas9-HPH的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.5所示；

將絲狀真菌N20表達框作為模板設計引物FFN20-F和FFN20-R，并擴增出帶有同源臂的FFN20表達框之后，利用內切酶KpnI將模板質粒pUCneo酶切成線性片段，并將線性片段與所述帶有同源臂的FFN20表達框進行克隆和測序驗證，獲得重組質粒pUCneo-FfN20；

將所述重組質粒pUC-Cas9-HPH-FFH2B與所述重組質粒pUCneo-FFN20同時轉化到絲狀真菌感受態細胞中，即可根據靶標基因進行編輯。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，根據NCBI獲取所述絲狀真菌H2B定位信號和所述5sRNA啟動子的核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述絲狀真菌包括藤倉赤霉菌、煙曲霉、黑曲霉。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述絲狀真菌選為藤倉赤霉菌時，相匹配的引物FfH2B-F的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3所示；相匹配的引物FfH2B-R的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.4所示。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，相匹配的引物FfN20-F的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.7所示；相匹配的引物FfN20-R的核苷酸序列為SEQ?IDNO.8所示。

6.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述絲狀真菌選為黑曲霉時，相匹配的引物AnH2B-F的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.13所示；所述引物AnH2B-R的核苷酸序列為SEQID?NO.14所示。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，相匹配的引物AnN20-F的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.16所示；相匹配的引物AnN20-R的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.17所示。

8.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述絲狀真菌選為煙曲霉時，相匹配的引物AfH2B-F的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.21所示；相匹配的引物AfH2B-R的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.22所示。

9.根據權利要求8所述的構建方法，其特征在于，相匹配的引物AfN20-F的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.24所示；相匹配的引物AfN20-R的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.25所示。

10.一種根據權利要求1-9所述方法構建的絲狀真菌通用CRISPR/Cas9編輯系統。