[發(fā)明專利]一種抗CA211納米抗體、制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310345914.0
• 申請日: 2023-04-03
• 公開（公告）號: CN116178539A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李泓彥;胡利華;山云;賴燕暉;范海艷;李琦
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市艾偉迪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/30;G01N33/574
• 代理公司: 深圳市精英創(chuàng)新知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44740
• 代理人: 葉鳳如

1.一種抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、用CA211抗原對成年羊駝進(jìn)行免疫，采集免疫成功的羊駝外周血，構(gòu)建一代納米抗體噬菌體展示文庫，進(jìn)行CA211納米抗體的初次篩選，獲得優(yōu)選納米抗體；

S2、對優(yōu)選納米抗體進(jìn)行重組表達(dá)和純化；

S3、對S2純化得到的納米抗體的CDR區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建二代納米抗體噬菌體展示文庫，進(jìn)行CA211納米抗體的二次篩選，得到抗CA211納米抗體。

2.如權(quán)利要求1所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中，還包括，從羊駝外周血分離出PBMC并提取RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以所述cDNA為模板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，將第二輪PCR產(chǎn)物與展示載體連接，構(gòu)建一代納米抗體噬菌體展示文庫；

其中，兩輪PCR擴(kuò)增所用引物分別為SEQ?ID?NO.1與SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3與SEQID?NO.4。

3.如權(quán)利要求1所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中，進(jìn)行CA211納米抗體的初次篩選具體操作如下：

以CA211抗原包被免疫管，用2-5％BSA封閉，PBST洗滌；加入100uL第一納米抗體噬菌體，室溫孵育1-3h，用PBST洗滌8-12次，用胰蛋白酶洗脫結(jié)合CA211的噬菌體；洗脫的噬菌體經(jīng)過轉(zhuǎn)染SS320后進(jìn)入下一輪篩選；經(jīng)過2-4輪篩選后，利用ELISA驗(yàn)證陽性克隆子，獲得優(yōu)選納米抗體，并測序。

4.如權(quán)利要求1所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，對S2純化得到的納米抗體的CDR區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變，具體包括：使用多段的簡并引物對CDR區(qū)域進(jìn)行多輪的PCR擴(kuò)增，得到的最后一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為突變后的DNA文庫；

其中，第一輪擴(kuò)增所用引物分別為SEQ?ID?NO.5，SEQ?ID?NO.6，SEQ?ID?NO.7，SEQ?IDNO.8；第二輪擴(kuò)增所用引物分別為SEQ?ID?NO.7，SEQ?ID?NO.6。

5.如權(quán)利要求4所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，還包括將最后一輪PCR產(chǎn)物與展示載體連接，構(gòu)建二代納米抗體噬菌體展示文庫。

6.如權(quán)利要求1所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，進(jìn)行CA211納米抗體的二次篩選，具體包括：

將PBS重懸后的二代納米抗體噬菌體加入2-5％的milk，封閉1h；同時封閉空管及磁珠2h；

二代納米抗體噬菌體封閉1h后加入CA211抗原，繼續(xù)封閉1h；之后，加入封閉好的磁珠，繼續(xù)封閉半小時；

隨后洗脫未結(jié)合的二代納米抗體噬菌體，更換封閉好的離心管，去除上清，洗脫去除磁珠；

將洗脫磁珠的二代納米抗體噬菌體經(jīng)過感染TG1進(jìn)入下一輪篩選，篩選2-5輪，每輪篩選后隨機(jī)挑單克隆進(jìn)行測序，分析序列富集程度，選取序列進(jìn)行表達(dá)。

7.如權(quán)利要求6所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中，還包括，將表達(dá)純化得到的納米抗體進(jìn)行活性檢測和親和力檢測，將檢測結(jié)果按優(yōu)到次排序，選取檢測結(jié)果為優(yōu)的納米抗體作為最佳的抗CA211納米抗體。

8.如權(quán)利要求1所述的抗CA211納米抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中，還包括，對純化得到的納米抗體進(jìn)行活性檢測和親和力檢測。

9.一種抗CA211納米抗體，其特征在于，由權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的制備方法制得。

10.如權(quán)利要求9所述的抗CA211納米抗體在制備免疫法檢測CA211試劑盒中的應(yīng)用。