[發明專利]一種漆酶突變體、其編碼基因、表達菌株及其應用

在審

• 申請號: 202310318953.1
• 申請日: 2023-03-29
• 公開（公告）號: CN116179501A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 房偉;劉帥峰;張學成;肖亞中
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 喬恒婷

本發明公開了一種漆酶突變體、其編碼基因、表達菌株及其應用。本發明以粗毛栓菌(Trametessp.)的漆酶LacB為出發搜索同源序列、分析其進化關系、通過祖先序列重建，獲得突變基因。含有突變基因的工程菌誘導表達后，獲得比酶活提高且穩定性提升的漆酶突變體LacANC，突變體的比酶活提高了3.5倍。在比活力提高的同時，突變體的穩定性提升了20倍，該突變體在氧化轉化黃曲霉毒素B1中具有潛在應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種漆酶突變體、其編碼基因、表達菌株及其應用。

背景技術

漆酶(laccase)是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類與非酚類物質的氧化，同時伴隨電子的轉移，將氧還原成水。漆酶底物廣泛，包括酚類及其衍生物、芳胺類及其衍生物。漆酶在生物修復、毒素氧化轉化、降解環境污染物等諸多領域具有潛在應用價值。

黃曲霉毒素B1是黃曲霉、寄生曲霉及特曲霉等真菌產生的次級代謝產物。大量的研究證實，黃曲霉毒素B1是現今發現的毒性和致癌性最強的污染物，該毒素作用的主要靶器官是肝臟，可導致肝臟壞死、肝癌的形成、造成動物免疫抑制及蛋奶產量下降等。

目前應用于黃曲霉毒素B1氧化轉化的漆酶，多為真菌發酵所產天然漆酶，在實際的毒素氧化轉化體系中，天然漆酶較易失活，因此需要對天然漆酶進行改造以篩選到穩定性較高的突變體。基于生物信息學技術，挖掘酶活力及穩定性較好的漆酶，應用于毒素氧化轉化亦是獲得優質脫毒酶的有效策略。基于對漆酶氨基酸序列、蛋白質結構的解析，利用生物信息學技術，有望從海量數據庫中精準篩選獲得新型目標酶蛋白。

發明內容

本發明提供了一種漆酶突變體、其編碼基因、表達菌株及其應用。本發明以粗毛栓菌(Trametessp.)的漆酶LacB為出發搜索同源序列、分析其進化關系、通過祖先序列重建，獲得突變基因。含有突變基因的工程菌誘導表達后，獲得比酶活提高且穩定性提升的漆酶突變體LacANC。以ABTS為底物時，突變體的比酶活提高了3.5倍。在比活力提高的同時，突變體的半衰期在60℃提升至350min，是出發酶的20倍。該突變體在氧化轉化黃曲霉毒素B1中具有潛在應用價值。實驗結果顯示，突變體LacANC對黃曲霉毒素B1的氧化轉化了17.7％的，出發酶LacB對黃曲霉毒素B1的氧化轉化為7.9％，氧化轉化效率提升了1.24倍。該突變體在黃曲霉毒素B1高效氧化轉化方面有潛在應用價值。

本發明漆酶突變體LacANC，其氨基酸序列為如SEQ?ID?No:1所示的漆酶氨基酸序列中第27位的丙氨酸突變為纈氨酸、第89位的絲氨酸突變為脯氨酸、第241位的絲氨酸突變為甘氨酸、第253位的絲氨酸突變為脯氨酸、第286位的異亮氨酸突變為脯氨酸、第291位丙氨酸到蘇氨酸、第341位谷氨酸突變為纈氨酸、第343位亮氨酸突變為苯丙氨酸、第368位蘇氨酸突變為脯氨酸、第376位亮氨酸突變為脯氨酸、第410位絲氨酸突變為色氨酸、第449位丙氨酸突變為脯氨酸且第475位脯氨酸突變為谷氨酸。

本發明漆酶酶突變體，其氨基酸序列還可以包括序列中的無義突變或同義突變的組合。

本發明漆酶突變體的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No:2所示。

本發明突變基因，為含有如SEQ?ID?No:2所述的漆酶突變體的編碼基因。

本發明漆酶突變體的表達菌株，含有所述突變基因。

本發明漆酶突變體的表達菌株，其分類命名為PichiapastorisGS115/pPic9k(+)-lacANC，已送至中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址：武漢大學，保藏日期為2023年3月3日，保藏編號為CCTCCNO：M2023238。

本發明漆酶突變體的表達菌株的構建方法，包括如下步驟：