[發明專利]一種特異性識別β-乳球蛋白的優化適配體及其應用

在審

• 申請號: 202310317396.1
• 申請日: 2023-03-29
• 公開（公告）號: CN116463350A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 段諾;齊碩;吳世嘉;王周平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 夏蘇娟

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種特異性識別β?乳球蛋白的優化適配體及其應用。該優化適配體由β?乳球蛋白原始適配體Lg?18經優化后得到，所述β?乳球蛋白原始適配體Lg?18的序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述優化的方式包括剪裁、堿基突變和結構優化。本發明以β?乳球蛋白為靶標，在SELEX篩選獲得的原始序列基礎上，結合剪裁、堿基突變以及結構強化等手段，獲得了能以高親和力及特異性識別結合β?乳球蛋白的優化適配體序列，該優化的適配體序列具有較高的結構穩定性，能有效降低適配體對應用環境體系的敏感性。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種特異性識別β-乳球蛋白的優化適配體及其應用。

背景技術

牛乳富含機體生長發育所必需的各種氨基酸及微量元素，素有“白色血液”之稱，因此深受人們喜愛。但其作為聯合國糧食及農業組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)劃定的八大類過敏食物之一，由牛乳引發的牛乳過敏(CMA)已逐漸成為嬰幼兒群體中最常見的食物過敏反應，嚴重影響著嬰幼兒群體的身體健康，甚至危及生命。近年來由于生活方式的改變、微生物的暴露、飲食習慣的改變等多種因素，嬰幼兒的腸道免疫功能越來越低，嬰幼兒牛乳過敏發生率正呈逐年上升的趨勢。據調查表明，約82％左右牛乳過敏群體的致敏原為β-乳球蛋白(β-Lg)，因此β-乳球蛋白被認為是牛乳中最主要的過敏原蛋白，可以看作為牛乳過敏原監測的標志物。因此，對食物過敏原β-乳球蛋白準確檢測既可以為生產者評估食物潛在致敏性風險提供重要依據，又可以為牛乳過敏群體的日常飲食提供有效指導。

目前食物過敏原β-乳球蛋白常用的檢測方法包括色譜分析技術、基于識別特征基因的分子生物學技術和基于抗原-抗體特異性識別酶聯免疫分析方法(ELISA)等，雖然，色譜分析技術(尤其LC-MS技術)因具有準確度高、特異性強、線性范圍寬等優點，但是樣品前處理復雜，需要昂貴儀器設備和專門的技術人員，制約了該技術的普及與推廣。分子生物學方法是一種間接檢測方法，依賴檢測特異性序列，需要篩選針對性的過敏原標志基因，而且并非每個過敏原都有合適的標志基因可被應用到實際樣本的檢測。另外食品加工的復雜處理過程可能會導致核酸降解，最終影響檢測結果。ELISA法雖有良好的特異性、準確性及較高的靈敏度的優點，但是制備特異性抗體過程仍然繁瑣且耗時，且制備出的抗體穩定性差，不易進行化學修飾，大大限制了過敏原β-乳球蛋白檢測方案的開發與應用。

適配體(aptamer)是通過指數富集配體進化技術(SELEX)從人工合成的隨機核苷酸文庫中篩選獲得能特異性結合靶物質的單鏈寡核苷酸。適配體在特定微環境體系內可形成特定的三維構象(發卡、假結、凸環和G-四聯體等)，通過空間結構的匹配、氫鍵、范德華力和靜電相互作用等分子間相互作用力與靶物質進行高親和性結合。與抗體相比具有很多優勢：(1)人工合成，不依賴動物體內免疫，批次之間的差異小；(2)穩定性好，可長期保存，耐熱性強；(3)親和力高，特異性強，適配體Kd可低至納摩爾級別，能很好的區分結構類似物；(4)易于修飾，適配體兩端標記化學基團(如FAM、ROX、FITC和生物素等)不影響其親和性。因此，適配體作為一種新型的識別分子在醫療診斷、環境監測和食品安全分析等領域具有無可比擬的優勢，且已被整合開發各類生物傳感/分析平臺。

一般情況下，通過SELEX技術直接篩選到的適配體含有70～130個核苷酸，包含兩端引物區和中間隨機序列區。但并不是所有的核苷酸都參與適配體與靶標的結合過程，非必需核苷酸序列區可能會形成各種二級結構從而干擾適配體與靶標的結合或者降低適配體-靶標復合物的構象穩定性，且較長的序列會帶來較低的產率和較高的合成成本。因此，實際使用中對適配體的序列進行剪裁優化，在保留適配體親和性能的前提下，獲得適配體最短序列大有裨益。此外，因其核酸的化學本性，適配體構象具有固有靈活性，本質上是動態的，并且具有包含相互轉換子狀態的巨大構象合集。這種過度靈活的構象通常會導致結合親和力減弱、脫靶相互作用以及對應用場景的高度敏感性，從而嚴重影響適配體在實際應用中的性能。因此，亟需對適配體采取一定的結構強化策略，以努力提高適配體構象穩定性，降低其結合性能對環境的敏感度，促進適配體的應用與發展。

發明內容