[發(fā)明專(zhuān)利]mRNA加帽酶及其制備方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310303706.4
• 申請(qǐng)日: 2023-03-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116355934A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧元;陳鑫杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12N9/14;C12N9/12;C12N9/10;C07K19/00;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

1.一種制備可溶性mRNA加帽酶的方法，包括如下步驟：

(A1)將融合蛋白的編碼基因?qū)氪竽c桿菌受體細(xì)胞，得到重組大腸桿菌；所述融合蛋白為將促溶標(biāo)簽MBP和來(lái)源于病毒的加帽酶通過(guò)連接肽融合而成；所述來(lái)源于病毒的加帽酶選自如下任一：來(lái)源于藍(lán)舌病毒的加帽酶、來(lái)源于浮病病毒的加帽酶、來(lái)源于非洲豬瘟病毒的加帽酶、來(lái)源于小球藻病毒的加帽酶；

(A2)對(duì)所述重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體進(jìn)行裂解，離心后從上清液中獲得所述融合蛋白，即為可溶性mRNA加帽酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

所述融合蛋白自N端到C端由所述促溶標(biāo)簽MBP、所述連接肽和所述源于病毒的加帽酶順次連接而成；和/或

所述來(lái)源于藍(lán)舌病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1的第1-644位或SEQ?IDNo.1所示；和/或

所述來(lái)源于浮病病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2的第1-879位或SEQ?IDNo.2所示；和/或

所述來(lái)源于非洲豬瘟病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3的第1-868位或SEQIDNo.3所示；和/或

所述來(lái)源于小球藻病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4的第1-330位或SEQIDNo.4所示；和/或

所述促溶標(biāo)簽MBP的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示；和/或

所述連接肽為柔性連接肽；進(jìn)一步地，所述連接肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.6所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的編碼基因?yàn)槿缦氯我唬?/p>

(B1)核苷酸序列如SEQ?ID?No.7的第1-3063位或SEQ?ID?No.7所示；

(B2)核苷酸序列如SEQ?ID?No.8的第1-3768位或SEQ?ID?No.8所示；

(B3)核苷酸序列如SEQ?ID?No.9的第1-3735位或SEQ?ID?No.9所示；

(B4)核苷酸序列如SEQ?ID?No.10的第1-2121位或SEQ?ID?No.10所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步驟(A1)中，所述融合蛋白的編碼基因是通過(guò)重組載體的形式導(dǎo)入所述大腸桿菌受體細(xì)胞中的；

進(jìn)一步地，所述重組載體為將所述融合蛋白的編碼基因插入到pET-21a(+)的多克隆位點(diǎn)處所得；

和/或

所述大腸桿菌受體細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步驟(A2)中，所述誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：37℃條件下，1mM?IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2h。

6.利用權(quán)利要求1-5中任一所述方法制備得到的可溶性mRNA加帽酶。

7.用于制備權(quán)利要求6所述可溶性mRNA加帽酶的成套產(chǎn)品，包括：

(C1)權(quán)利要求4中所述的重組載體；

(C2)權(quán)利要求1-4任一中所述的大腸桿菌受體細(xì)胞。

8.權(quán)利要求6所述可溶性mRNA加帽酶在對(duì)mRNA進(jìn)行5’端加帽修飾中的應(yīng)用。

9.一種mRNA體外轉(zhuǎn)錄-加帽方法，包括如下步驟：

S1、制備T7?RNA聚合酶，按照包括如下步驟的方法進(jìn)行：

(a1)將融合了純化標(biāo)簽的T7?RNA聚合酶的編碼基因?qū)氪竽c桿菌受體細(xì)胞，得到重組大腸桿菌；所述融合了純化標(biāo)簽的T7?RNA聚合酶為在T7?RNA聚合酶的N端融合了6His標(biāo)簽或8His標(biāo)簽；

(a2)對(duì)所述重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體進(jìn)行裂解，離心后從上清中分離純化獲得T7?RNA聚合酶；

S2、按照權(quán)利要求1-5中任一所述方法制備得到mRNA加帽酶；

S3、先采用S1制得的T7?RNA聚合酶進(jìn)行mRNA體外轉(zhuǎn)錄，然后采用S2制得的mRNA加帽酶對(duì)體外轉(zhuǎn)錄所得mRNA進(jìn)行5’端加帽修飾。

10.一種用于mRNA體外轉(zhuǎn)錄-加帽的成套產(chǎn)品，包括：

(D1)權(quán)利要求9中所述融合了純化標(biāo)簽的T7?RNA聚合酶；

(D2)權(quán)利要求6所述可溶性mRNA加帽酶。