[發明專利]一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202310276079.X
• 申請日: 2023-03-21
• 公開（公告）號: CN116555488A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 李論;高利芬;彭海;原霖;張淼潔;陳亞娜;方治偉;周俊飛;李甜甜;陳利紅;肖華鋒;宋會銀;萬人靜
• 申請（專利權）人: 江漢大學;北京中科基因技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 王杰

本申請涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及應用；所述MNP標記位點為在PRRSV基因組上篩選的具有亞型特異性的、且在亞型內部具有多個核苷酸多態性的基因組區域；所述MNP標記位點包括MNP?1至MNP?5的5個標記位點；并根據發現的MNP標記位點設計多重引物組合物，可以利用設計的多重引物組合物進行多重PCR擴增，并融合二代測序平臺進行擴增產物的測序，滿足對PRRSV的2個亞型高通量、高效率、高準確性和高靈敏度的檢測的需求。

技術領域

本申請涉及生物技術領域，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及應用。

背景技術

豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)是秋冬季節最常見的引起豬繁殖障礙和呼吸道疾病的病原體，是一種RNA病原體，其具有傳播快和變異快的特點，嚴重危害豬的健康和規模豬場的經濟效益。PRRSV主要包括歐洲型和美洲型2個亞型。已有的針對引起豬病的病原體檢測和分型方法包括基于抗原抗體反應的免疫學方法和基于熒光PCR的分子生物學方法。但這些方法一次只檢測其一種亞型，且一種亞型只檢測一個標記；PRRSV毒株的高變異也常導致現有檢測體系檢測失敗，另外上述方法不能檢測序列變異，因此存在檢測效率低和準確性低的局限；而基于測序技術的方法，比如宏基因組測序技術，可以同時檢測各種亞型和檢測序列變異，但往往包括大量的宿主測序數據，在對病原體低濃度的樣本進行檢測時，需要超深度的測序，導致超高的難以接受的測序成本。已有的分型方法主要通過檢測SNP標記進行亞型的區分，但SNP標記存在多態性低，分型錯誤率高和物種區分能力弱的局限。同時微生物為群體性生物，群體中個體的變異導致在一個標記位點會存在多個等位基因型且存在低頻的基因型，而SNP標記是二態性標記，難以捕獲群體生物普遍存在的多等位基因型，存在標記多態性低、檢測方法準確性和靈敏度低的缺陷。

因此如何提供PRRSV高多態性的新型分子標記，以實現在一個反應中對兩種亞型多個標記進行高效、準確和靈敏的檢測，是目前亟需解決的技術問題。

發明內容

本申請提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及應用，以解決現有技術中難以在一個反應中對多種亞型進行高效、準確和靈敏的檢測的技術問題。

第一方面，本申請提供了一種PRRSV的MNP標記位點，所述MNP標記位點為在PRRSV基因組上篩選的具有亞型特異性的、且在亞型內部具有多個核苷酸多態性的基因組區域；所述MNP標記位點包括MNP-1至MNP-5的5個標記位點的至少一個。

可選的，所述PRRSV包括歐洲型和美洲型中的至少一種。

第二方面，本申請提供了一種用于檢測第一方面所述的MNP標記位點的多重PCR引物組合物，所述多重PCR引物組合物包括第一引物對、第二引物對、第三引物對、第四引物對、第五引物對中的至少一對；

所述第一引物對的上游引物如SEQ?ID?NO.1所示，所述第一引物對的下游引物如SEQ?ID?NO.2所示；

所述第二引物對的上游引物如SEQ?ID?NO.3所示，所述第二引物對的下游引物如SEQ?ID?NO.4所示；

所述第三引物對的上游引物如SEQ?ID?NO.5所示，所述第三引物對的下游引物如SEQ?ID?NO.6所示；

所述第四引物對的上游引物如SEQ?ID?NO.7所示，所述第四引物對的下游引物如SEQ?ID?NO.8所示；

所述第五引物對的上游引物如SEQ?ID?NO.9所示，所述第五引物對的下游引物如SEQ?ID?NO.10所示。

第三方面，本申請提供了一種用于檢測第一方面所述的MNP標記位點的試劑盒，所述試劑盒包括第二方面所述的多重PCR引物組合物。

可選的，所述試劑盒還包括多重PCR預混液。