[發明專利]基于麥胚的體外蛋白表達方法

在審

• 申請號: 202310255563.4
• 申請日: 2023-03-16
• 公開（公告）號: CN116042755A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 趙瑞;梁杉;王翊靜
• 申請（專利權）人: 保定米奇生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N15/70
• 代理公司: 河北星冀專利代理事務所(特殊普通合伙) 13166
• 代理人: 耿文杰

本發明涉及蛋白質合成技術領域，提出了一種基于麥胚的體外蛋白表達方法，包括麥胚抽提物、底物緩沖液和肌酸激酶溶液，所述底物緩沖液包括100mM?HEPES、350mM醋酸鉀、12mM醋酸鎂、2.5mM亞精胺、25mM二硫蘇糖醇、6mM氨基酸、120mM磷酸肌酸。通過上述技術方案，解決了現有技術中目的蛋白表達耗時長的問題。

技術領域

本發明涉及蛋白質合成技術領域，具體的，涉及一種基于麥胚的體外蛋白表達方法。

背景技術

蛋白質是生物體內重要的大分子，是細胞的重要組分。人的生長發育、健康、疾病和蛋白質具有非常緊密的關系。蛋白質是成藥位點，很多藥物都靶向到蛋白質上，達到治療疾病的目的。要進行藥物的設計，就要對不同蛋白質的結構與功能進行分析，對不同蛋白質的結構與功能進行分析的前提是進行蛋白質的表達與純化。

傳統的蛋白表達純化的方法，是構建蛋白表達載體，轉化到原核蛋白表達菌株中，進行誘導、表達與純化，然后進行后續研究。這種方法要進行載體構建、轉化克隆宿主菌、鑒定陽性克隆、提取表達載體、轉化蛋白表達宿主菌、鑒定陽性克隆、小量培養、小量誘導檢測目的蛋白是否表達、大量培養、誘導蛋白表達、離心收集菌體、超聲破碎裂解、低溫離心、與樹脂填料結合、過柱純化。傳統方法過程繁瑣、需要很多儀器和設備、目的蛋白有可能無法正常表達、耗時很長(一個月到六個月)、成功率低。因此需要開發一種反應流程簡便，反應時間短的蛋白表達方法，提高蛋白表達的效率。

發明內容

本發明提出一種基于麥胚的體外蛋白表達方法，解決了相關技術中目的蛋白表達耗時長的問題。

本發明的技術方案如下：

一種基于麥胚的體外蛋白表達預混液，包括麥胚抽提物、底物緩沖液和肌酸激酶溶液，所述底物緩沖液包括100mM?HEPES、350mM醋酸鉀、12mM醋酸鎂、2.5mM亞精胺、25mM二硫蘇糖醇、6mM氨基酸、120mM磷酸肌酸。

作為進一步技術方案，所述麥胚抽提物的制備方法為：

S1、將麥胚依次使用裂解液、超純水清洗，加入液氮研磨；

S2、加入提取緩沖液混合后，離心，取上清液；

S3、將上清液過柱后，冷凍，得到麥胚抽提物。

作為進一步技術方案，所述S1中裂解液為NP-40裂解液。

作為進一步技術方案，所述S2中提取緩沖液為：100mM?HEPES、400mM醋酸鉀、20mM醋酸鎂、6mM氯化鈣、12mM氨基酸和1mM二硫蘇糖醇。

作為進一步技術方案，所述S3中過柱為將上清液依次經提取緩沖液預平衡凝膠柱和底物緩沖液預平衡凝膠柱進行處理。

作為進一步技術方案，所述提取緩沖液預平衡凝膠柱填料包括100mM?HEPES、400mM醋酸鉀、20mM醋酸鎂、6mM氯化鈣、12mM氨基酸和1mM二硫蘇糖醇。

作為進一步技術方案，所述底物緩沖液預平衡凝膠柱填料包括100mM?HEPES、350mM醋酸鉀、12mM醋酸鎂、2.5mM亞精胺、25mM二硫蘇糖醇、6mM氨基酸、120mM磷酸肌酸。

作為進一步技術方案，所述肌酸激酶溶液的濃度為50mg/mL。

一種基于麥胚的體外蛋白表達方法，將目的基因與所述的基于麥胚的體外蛋白表達預混液混合，反應，得到目的蛋白；所述目的基因包括環狀雙鏈DNA、線狀雙鏈dsDNA、mRNA中的一種；所述目的基因經克隆得到，所述轉錄過程中啟動子包括T7、Tac、SP6中的一種。

作為進一步技術方案，所述反應溫度為30℃，反應時間2-4h。

本發明的工作原理及有益效果為：