[發(fā)明專利]兩種新型核酸內(nèi)切酶及其在核酸檢測中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310247616.8
• 申請日: 2023-03-10
• 公開（公告）號: CN116410955A
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝勝松;趙書紅;李新云;孫昊文;趙長志;陶大剛;徐兵榮;李晟
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12Q1/6818;C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗

本發(fā)明公開了兩種CRISPR/Cas系統(tǒng)的新型核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用，具體地，本發(fā)明首次提供了兩種結(jié)合宏基因組學(xué)與實驗手段挖掘到的新型CRISPR/Cas12a系統(tǒng)家族新成員Gs12?3、Gs12?5，特別是新發(fā)現(xiàn)的Gs12?3與已知Cas12a蛋白相比具有覆蓋靶標位點范圍更廣的基因組編輯能力，還建立了基于CRISPR/Gs12?3系統(tǒng)介導(dǎo)的核酸可視化檢測技術(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因組編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及新鑒定的CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸內(nèi)切酶Gs12-3、Gs12-5及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

CRISPR(Clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats)是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列，是古菌和細菌抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。某些細菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的DNA里一個稱為CRISPR的存儲空間。當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據(jù)存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是最常用的II型CRISPR系統(tǒng)，Cas9結(jié)合的靶位點必須包含原間隔鄰接基序(PAM)，該鄰近基序在單向?qū)NA(sgRNA)結(jié)合之前通過蛋白質(zhì)-DNA相互作用被識別。這種PAM要求對于實現(xiàn)精準編輯影響很大，無合適PAM時導(dǎo)致不能進行精準的基因編輯，PAM識別序列為“NGG”的活性較高的SpCas9核酸酶，最早被應(yīng)用于真核生物的基因編輯，除此之外，還有V型PAM識別序列為“TTTN”Cas12a蛋白。與Cas9相比，Cas12a具有多個優(yōu)勢，如向?qū)NA較短，更容易被遞送至細胞中；切割后產(chǎn)生粘性末端，更利于基因組精準識別編輯；切割位點與其識別位點距離較遠，可實現(xiàn)連續(xù)多次編輯的目的。然而，大多數(shù)哺乳動物的基因是富含GC的，這意味著很容易找到必要的GG來將Cas9定位于一個特定位置。相比之下，很難找到必要的TT來將Cas12定位于一個特定位置，這限制了Cas12精確基因編輯方法的適用性。現(xiàn)有研究表明，約40％和90％已測序的細菌及古菌基因組中均存在多樣化的CRISPR-Cas系統(tǒng)，但相對于廣袤的基因資源，目前鑒定的CRISPR-Cas成員十分有限，進一步挖掘CRISPR-Cas12新成員，構(gòu)建簡單、高效、精準、應(yīng)用范圍廣的基因組編輯新系統(tǒng)一直是研究者努力的重要方向。

Cas12有一個獨特屬性，它適合于基因組編輯之外的另一種應(yīng)用：對單鏈DNA的非特異性切割。這種能力可以切割特定單鏈DNA探針(熒光和淬滅標記)，實現(xiàn)核酸檢測。擴增的雙鏈DNA，在crRNA的引導(dǎo)下Cas12a可以切割雙鏈模板DNA和熒光標記探針，探針被水解后釋放出熒光信號，通過檢測熒光信號便可知道是否有DNA模板。基于Cas12a蛋白介導(dǎo)的核酸可視化檢測技術(shù)是目前最具前景的診斷手段，具備操作簡便、耗時短、價格低廉等優(yōu)點。

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine?circovirus?type?2，PCV2)是嚴重威脅全球生豬養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。感染PCV2不僅會引發(fā)多種豬疾病，還能誘導(dǎo)宿主免疫持續(xù)抑制，極易與其他病原發(fā)生共感染而引發(fā)嚴重的病癥。目前，抗生素對其治療效果不大，故病毒核酸的早期檢測對于疫情控制非常關(guān)鍵。目前已有的檢測方法有常規(guī)的熒光定量PCR，快速核酸檢測的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)和重組酶聚合酶擴增法(RPA)等，但是常規(guī)的檢測方法通常需要昂貴儀器，操作繁瑣，成本高，恒溫擴增方法在高速擴增過程中易造成假陽性。而CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在恒溫擴增方法的基礎(chǔ)上加入了特異性切割檢測，可以在提高檢測方法的靈敏性的同時又能避免假陽性。因此，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)介導(dǎo)的低成本、可現(xiàn)場化的PCV2核酸檢測方法將有利于該病的防控。

因此，本領(lǐng)域仍然亟需尋找編輯活性高、PAM序列簡單且基因組覆蓋范圍廣、特異性高的新型CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)，同時利用LAMP技術(shù)和新型CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)技術(shù)實現(xiàn)快速檢測PCV2相關(guān)病的方法。

發(fā)明內(nèi)容