[發(fā)明專利]一種明膠微球載體及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310245871.9
• 申請日: 2023-03-15
• 公開（公告）號: CN116462879A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方達(dá)通;丁鵬飛;黎鐘秀;甘武
• 申請（專利權(quán)）人: 上海英拜生物科技有限公司
• 主分類號: C08J7/12
• 分類號: C08J7/12;C12N5/00;C12N5/074;C08J3/12;C08L89/00;C08K5/1545;C08K5/092
• 代理公司: 北京知匯林知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11794
• 代理人: 楊華

本申請公開了一種明膠微球載體及其應(yīng)用，以明膠為主體，制成水溶液，加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH至酸性可抑制交聯(lián)劑京尼平的反應(yīng)，再加入京尼平為交聯(lián)劑，通過滴注進(jìn)入液氮冷凍一步成型，再與碳酸氫鈉反應(yīng)將pH調(diào)節(jié)至堿性，促進(jìn)京尼平進(jìn)行交聯(lián)固化，得到明膠微球載體。本申請的明膠微球載體制備工藝簡單，穩(wěn)定性強利于儲藏、且制備成本低，對細(xì)胞無害、能有效負(fù)載細(xì)胞并擴增細(xì)胞，可用于細(xì)胞3D培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及生物醫(yī)藥材料技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種明膠微球載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

與傳統(tǒng)的平面細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能夠較為真實地模擬生物體內(nèi)細(xì)胞的存活環(huán)境，更逼真的還原出細(xì)胞間相互作用和生理生化反應(yīng)，以及細(xì)胞對內(nèi)源性和外源性刺激如溫度、pH、轉(zhuǎn)運和分化等方面的改變所作出的實際應(yīng)答。3D細(xì)胞培養(yǎng)可以用于構(gòu)建類器官模型或是腫瘤模型，以更為準(zhǔn)確貼合的方式進(jìn)行如藥物的代謝動力學(xué)研究、藥效評估以及更加直觀的細(xì)胞生物學(xué)方面的研究，使得3D細(xì)胞培養(yǎng)成為必不可少的研究工具。

目前，以明膠作為細(xì)胞負(fù)載基質(zhì)或是制成球型載體是當(dāng)前3D細(xì)胞培養(yǎng)的研究熱點。明膠是動物膠原蛋白部分水解后的主要產(chǎn)物，具有良好的生物降解性、生物相容性、無毒性、親水性和非免疫原性等生物特性，在藥品、食品、組織工程、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域都是廣泛應(yīng)用的功能性生物高分子材料。

明膠微球的制備技術(shù)較為成熟，目前有乳化交聯(lián)、溶劑揮發(fā)、噴霧干燥和相分離等多種制備方法。大部分方法都是通過油相和水相乳化攪拌剪切成球，再使用交聯(lián)劑如甲醛、戊二醛固化成明膠微球。也有使用其他交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)的，如CN109793717A公開了一種明膠微球的制備方法與應(yīng)用，以明膠水溶液為水相，石蠟為油相乳化攪拌成球經(jīng)過冷凍后，再由京尼平進(jìn)行交聯(lián)。或者是通過微流控制芯片成型的方法，如CN110200922B公開了一種明膠微球的制備方法及應(yīng)用，以明膠水溶液為水相，油為油相經(jīng)過微流控裝置成液滴進(jìn)入收集相，然后在4-12℃下成膠，最后使用京尼平進(jìn)行交聯(lián)。這兩個制備方法所使用的交聯(lián)劑京尼平是一種植物天然交聯(lián)劑，可以與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料，其毒性遠(yuǎn)低于戊二醛和其他常用化學(xué)交聯(lián)劑，但是這兩個制備方法在微球成型過程中需要使用油相。再如CN112250892A先將明膠溶液進(jìn)行噴霧干燥或是噴霧凍干處理獲得微球前體，微球前體再于不良溶劑如甲醇、丙酮及乙腈等溶劑或水溶液中進(jìn)行交聯(lián)固化，但是CN112250892A在固定階段使用有機溶劑固化或有機溶劑進(jìn)行保護(hù)球體形狀，在成球后必須設(shè)法除去使得清洗步驟較為麻煩，加大成本。也有未使用交聯(lián)劑進(jìn)行固化微球的，如CN112266487A是以殼聚糖為骨架固定明膠，將殼聚糖明膠溶液冷凍噴霧處理，再于賦形劑如糖、葡聚糖、明膠、甘露醇等保護(hù)下凍干處理得到微球，但是該方法需要噴霧干燥以及多次冷凍干燥處理，制備過程復(fù)雜時間較長，涉及不同設(shè)備的使用，加大成本。因此，需要提供一種制備過程簡單安全，綠色環(huán)保且不傷害細(xì)胞的活性，能夠有利于干細(xì)胞貼附以及擴增，且節(jié)省成本方便大規(guī)模生產(chǎn)的微球的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種一種明膠微球載體，采用如下方法制備：

步驟一，取明膠溶于溫水中，攪拌均勻，得到明膠水溶液；

步驟二，將檸檬酸加入步驟一制備的明膠水溶液調(diào)節(jié)pH≤3，溶解拌勻，得到檸檬酸明膠溶液；使用檸檬酸調(diào)節(jié)明膠水溶液的pH≤3可以抑制交聯(lián)劑的反應(yīng)活性，延長明膠、檸檬酸和京尼平混合溶液的使用時間。

步驟三，將京尼平粉末加入到步驟二制備的檸檬酸明膠溶液，溶解拌勻，制成明膠混合溶液；

步驟四，將步驟三制備的明膠混合溶液滴注至液氮中，凝固成型，得到明膠微球；

步驟五，將步驟四制備的明膠微球放入碳酸氫鈉溶液中，反應(yīng)3h或待球體變?yōu)闇\藍(lán)色提示反應(yīng)完成后，用水洗凈獲得明膠微球載體。

進(jìn)一步的，所述的明膠微球載體的制備方法還包括如下(1)-(7)中的一項或多項：

(1)每升所述明膠水溶液中明膠的添加量為50-300g；