[發明專利]幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥性分析試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202310214721.1
• 申請日: 2023-03-08
• 公開（公告）號: CN116377096A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 朱民;唐欣;雷芙蓉
• 申請（專利權）人: 上海粒盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京方政衛士專利代理事務所(普通合伙) 16080
• 代理人: 王超

本發明公開一種用于幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥性的分析試劑盒的等位特異性引物，包括針對幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥性相關基因設計的引物，其中，幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥性相關基因選自幽門螺旋桿菌23S，檢測位點為A2143G，A2142C，A2142G和無基因突變位點，A2143G，A2142C，A2142G位點為克拉霉素耐藥型，無基因突變為克拉霉素敏感型；還公開了用于幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥性的分析試劑盒和耐藥性診斷的診斷試劑盒，與分析試劑盒配套的熒光定量PCR反應體系，幽門螺旋菌克拉霉素耐藥性檢測方法，檢測方法在非疾病診斷和治療為目的的方法以及在藥物的研發和/或篩選的應用，能告知病人是否同時有克拉霉素敏感型和耐藥型幽門螺旋桿菌兩種菌株雙重感染，提供準確臨床用藥信息。

技術領域

本發明涉及醫學和生物技術領域，尤其涉及一種應用等位特異性引物檢測幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥性分析試劑盒及耐藥性檢測方法。

背景技術

幽門螺旋桿菌(Helicobacter?Pylori，H.pylori)生存于人體胃部，是最常見的細菌病原體之一，世界有多半人口受到過幽門螺旋桿菌的感染。幽門螺旋桿菌感染可能引起慢性胃炎、消化性潰瘍，嚴重者則發展為胃癌、胃黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤。隨著抗生素的廣泛使用，幽門螺旋桿菌耐藥菌株也在日益增多，幽門螺旋桿菌對抗生素產生耐藥已經成為其根除率下降的最主要原因，這不但給臨床治療帶來困難，也增加了患者的經濟負擔，導致醫療資源極大浪費。耐藥性檢測是實施個體化治療的前提，可以避免重復使用已經產生耐藥性的抗生素、并根據藥敏實驗選擇有效抗生素。目前，已有多種檢測幽門螺旋桿菌抗生素耐藥性的方法，傳統方法檢測幽門螺旋桿菌抗生素耐藥性主要局限于藥敏試驗，但E-test耗材昂貴，紙片擴散法缺乏有效的判斷標準，瓊脂稀釋法對操作技術要求較高；而且藥敏試驗不能鑒定H.pylori菌株基因突變的位點。另外，幽門螺旋桿菌對培養要求苛刻，微需氧條件下生長緩慢，不適合臨床常規開展。如：①分離培養鑒定：幽門螺旋桿菌培養成菌落后，經生化反應鑒定。由于幽門螺旋桿菌培養需要微需氧條件，對營養條件要求苛刻，所以極易造成假陰性，其靈敏度僅有40％-70％，檢出率低。且幽門螺旋桿菌培養需要一定時間，不利于快速診斷。②UBT：根據標志物不同可分為13C-UBT和14C-UBT，臨床應用廣泛，技術要求低。缺點是費用高，易受抑酸劑和抑菌藥物影響，敏感度低。③免疫學檢查：檢測糞便中幽門螺旋桿菌的抗原或血清中幽門螺旋桿菌抗體。優點是快速、無損傷，缺點是不能判斷現癥感染還是既往感染。④組織病理切片染色法：該法是把患者胃鏡檢查活檢組織切片,染色后觀察組織中的幽門螺旋桿菌。優點是可同時進行胃黏膜的病理學診斷，且特異性和敏感性均較高。但該方法受幽門螺旋桿菌載量影響明顯，且操作繁瑣、費時，不適于大通量樣本的檢測。隨著分子生物學技術的發展，PCR、熒光原位雜交、基因芯片、DNA測序等技術已被用于幽門螺旋桿菌抗生素耐藥性的檢測，包括：普通PCR、寡核苷酸探針雜交、基因芯片、測序等。以上所有檢查方法各有特點，但均不能在一份樣本中同時檢測出耐藥性菌株和敏感性菌株的雙重感染。我們采用本公司設計的這項等位基因特異性熒光PCR技術，已發現患者同時感染幽門螺旋桿菌耐藥性菌株和敏感性菌株的現象很常見（見圖2中樣本22和26）。

在幽門螺旋桿菌感染中，尤其在兒童幽門螺旋桿菌感染的治療中，克拉霉素是重要的首選藥物之一。然而，當前克拉霉素耐藥性菌株的感染幾乎占了所有幽門螺旋桿菌病人的三分之一，給臨床治療帶來很大的困難，造成病情久治不愈。通過研究發現，克拉霉素的藥用靶位點是幽門螺旋桿菌核糖體23S，而出現耐藥性則是幽門螺旋桿菌23S基因的2142核苷酸位點上發生A?to?G或A?to?C突變，或者2143核苷酸位點上發生A?to?G突變。2143位點A?to?G突變最為常見而2142位點A?to?C突變引起的耐藥性最強。

目前某些公司和研發機構檢測上述與克拉霉素耐藥相關的基因突變主是應用基因測序和TaqMan探針法技術。基因測序能精確地得知突變基因位點，但步驟相對較多，時間長；TaqMan探針法能測出探針覆蓋區域（約10個左右核苷酸）有無基因突變，但無法得知具體的突變點和突變核苷酸。倘若病人同時感染了克拉霉素敏感型和耐藥型幽門螺旋桿菌，基因測序和TaqMan探針技術均不能明確地告知。