[發明專利]骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝

在審

• 申請號: 202310205513.5
• 申請日: 2023-03-06
• 公開（公告）號: CN116041479A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 易紅飛;胡慧芳
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K14/51
• 分類號: C07K14/51;C12N15/70;C07K1/22;C07K1/36;C07K1/14;C12N15/12;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

1.一種骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于其步驟包括：

(1)包涵體的表達：構建并培養帶His標簽的表達骨形態發生蛋白BMP-4的基因工程菌，誘導目的蛋白的表達，其中所述骨形態發生蛋白BMP-4的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示；

(2)包涵體的收集：去上清，收集菌體，破碎菌體，離心收集沉淀；

(3)包涵體的洗滌：用洗滌溶液洗滌步驟(2)收集的沉淀，獲得洗滌后的包涵體；

(4)包涵體的變性：用變性溶液溶解步驟(3)洗滌后的包涵體，過濾，除去沉淀，收集濾液；

(5)包涵體的復性：在步驟(4)濾液中加入稀釋溶液進行包涵體的復性，將復性液透析至透析溶液中；

(6)Ni柱親和純化，獲得正確折疊的BMP-4蛋白。

2.根據權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于所述洗滌溶液洗滌具體為：依次加入洗滌溶液1、洗滌溶液2、洗滌溶液3、洗滌溶液4、洗滌溶液5進行洗滌；

其中所述洗滌溶液1的配比包括10-30mM?Tris，50-150mM?NaCl，0.8-1.2M?Urea，

pH7.5-8.5；

其中所述洗滌溶液2的配比包括10-30mM?Tris，50-150mM?NaCl，1.6-2.4M?Urea，

pH7.5-8.5；

其中所述洗滌溶液3的配比包括10-30mM?Tris，50-150mM?NaCl，2.5-3.5M?Urea，

pH7.5-8.5；

其中所述洗滌溶液4的配比包括10-30mM?Tris，50-150mM?NaCl，1.6-2.4M?Urea，

pH7.5-8.5；

其中所述洗滌溶液5的配比包括10-30mM?Tris，50-150mM?NaCl，pH7.5-8.5。

3.根據權利要求2所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于所述洗滌溶液洗滌更具體的為：加入洗滌溶液1，6000-10000rpm，離心8-12min；

加入洗滌溶液2，6000-10000rpm，離心8-12min；

加入洗滌溶液3，6000-10000rpm，離心8-12min；

加入洗滌溶液4，6000-10000rpm，離心8-12min；

加入洗滌溶液5，6000-10000rpm，離心8-12min。

4.根據權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于所述變性溶液包含10-30mM?Tris，50-150mM?NaCl，4-6mMβ-ME，7-9M?Urea，pH7.5-8.5。

5.根據權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于所述稀釋溶液的成分包括：40-60mM?Tris，4-6mM?EDTA，450-550mM精氨酸，1.5-2.5mM?GSSG，0.8-1.2mM?GSH，pH7.5-8.5。

6.根據權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于步驟(1)中加入1mM?IPTG進行誘導表達。

7.根據權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于還包括步驟(7)：將Ni柱純化后的產物通過分子篩進行分選，將BMP-4的單體、二聚體和多聚體進一步分離。

8.根據權利要求7所述的骨形態發生蛋白BMP-4的表達及純化工藝，其特征在于步驟(7)具體為：

1)柱平衡：用PBS平衡分子篩；

2)上樣：將所述Ni柱純化后的產物濃縮、離心處理后，將濃縮后樣品注入上樣環中，通過上樣環上樣；

3)洗脫液收集：待A280吸收峰大于10mAU時，收集目的蛋白峰對應的產物，即為所述BMP-4二聚體。

9.一種骨形態發生蛋白BMP-4，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

10.權利要求9所述的骨形態發生蛋白BMP-4的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。