[發(fā)明專利]茯苓酸合成的關鍵基因及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310204500.6
• 申請日: 2023-03-06
• 公開（公告）號: CN116286887A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 金劍;王紫菱;謝珍妮;鐘燦;張水寒
• 申請（專利權）人: 湖南省中醫(yī)藥研究院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/81;C12N1/19;C12P33/00
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 戴明虎;邵玉龍

本發(fā)明公開了茯苓酸合成的關鍵基因及應用，該茯苓酸合成的關鍵基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；關鍵基因包括PcCPR和CYP5035，PcCPR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，CYP5035的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；PcCPR和CYP5035均在pESC?Trp載體質(zhì)粒上；PcCPR和CYP5035均位于半乳糖啟動子之后；PcCPR位于GAL10啟動子之后，CYP5035位于GAL1啟動子之后，GAL10啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，GAL1啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。本發(fā)明通過大量前期篩選和實驗，找到了以羊毛甾醇為底物，進行C?16羥基化和C?20甲基羧基化的茯苓酸合成關鍵酶基因CYP5035；本發(fā)明有望構建完整的茯苓酸生物合成通路，闡釋茯苓活性物質(zhì)合成的內(nèi)在品質(zhì)屬性，也可為茯苓酸生物合成細胞工廠研究應用提供數(shù)據(jù)支持，促進中藥資源的創(chuàng)新發(fā)展。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，尤其涉及茯苓酸合成的關鍵基因及應用。

背景技術

目前茯苓野生資源瀕臨枯竭，茯苓酸在茯苓藥材中含量低，嚴重限制了茯苓酸的藥用開發(fā)。因此，挖掘茯苓酸的生物合成關鍵酶，將茯苓酸合成與異源表達結合起來，使原本在茯苓等中草藥中才能合成的茯苓酸在微生物(如酵母等)中也能合成，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

基于背景技術存在的技術問題，本發(fā)明提出了茯苓酸合成的關鍵基因及應用，。

本發(fā)明提出的茯苓酸合成的關鍵基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明提出的載體，包含上述茯苓酸合成的關鍵基因。

本發(fā)明提出的微生物，包含上述載體。

本發(fā)明提出的上述微生物在茯苓酸合成中的應用。

本發(fā)明的有益技術效果：

茯苓野生資源瀕臨枯竭，茯苓酸在茯苓藥材中含量低等問題，嚴重限制了茯苓酸的藥用開發(fā)。本專利發(fā)明的基因首次構建了茯苓酸從頭合成全路徑，挖掘得到的茯苓酸的生物合成關鍵酶，不僅可以用于茯苓生物育種和代謝調(diào)控來提高茯苓藥材中茯苓酸含量，同時也將茯苓酸合成與異源表達結合起來，使原本在茯苓等中草藥中才能合成的茯苓酸在酵母等微生物中也能合成，可以使茯苓酸的含量大大提高，液體發(fā)酵后含量可高達17.632ug/L，并降低其生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提出的pESC-Trp、pESC-Trp-PcCPR、pESC-Trp-CYP5035、pESC-Trp-CYP5035-PcCPR等異源表達載體的構建；

圖2為本發(fā)明提出的含pESC-Trp、pESC-Trp-PcCPR、pESC-Trp-CYP5035、pESC-Trp-CYP5035-PcCPR基因的酵母平板圖；

圖3為本發(fā)明提出的載體中插入基因的PCR驗證圖；M，marker?ladder，1,CYP5035引物PCR檢測pESC-Trp；2,CYP5035引物PCR檢測pESC-Trp-PcCPR；3,CYP5035引物PCR檢測pESC-Trp-CYP5035；4,引物CYP5035?PCR檢測pESC-Trp-CYP5035-PcCPR；5,引物PcCPR?PCRpESC-Trp；6,引物PcCPR?PCR檢測pESC-Trp-PcCPR；7,引物PcCPR?PCR檢測pESC-Trp-CYP5035；8,引物PcCPR?PCR檢測pESC-Trp-CYP5035-PcCPR；