[發明專利]一種基于菊花B病毒外殼蛋白特異性片段制備多克隆抗體

在審

• 申請號: 202310194485.1
• 申請日: 2023-02-23
• 公開（公告）號: CN116239657A
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發明（設計）人: 毛碧增;陳正賢;王瑋
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C07K19/00;C12N15/70;C07K16/10;G01N33/569
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.抗原決定簇，其特征在于其氨基酸序列為如下任一：

CVB-CP-A：

IGRPALQPPPNMRGDPTNMYSQVSTDFLWKIKPQRISNNMATSEDMVKIQVALEGLGVPT；

CVB-CP-B：MHLQQTPPSDWSAMGFHPNVKYAAFD。

2.如權利要求1所述的抗原決定簇的獲取方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、將CVB外殼蛋白的氨基酸序列輸入SWISS-MODEL，進行CVB外殼蛋白的三維結構預測；

2)、根據步驟1)預測所得的三維結構，選擇外露結構區域序列等為候選抗原決定簇；

3)、將步驟2)所得的候選抗原決定簇進行二維結構氨基酸的親水性的偏好性分析，從而驗證三維結構中所選擇的片段是否符合抗原決定簇的要求；

4)、獲得抗原決定簇CVB-CP-A、CVB-CP-B。

3.根據權利要求2所述的抗原決定簇的獲取方法，其特征在于：所述步驟2)的二維結構氨基酸的親水性的偏好性分析包括Chou?Fasman?Beta?Turn預測、Emini表面可達性預測、Karplus?Schulz柔韌性預測、Kolaskar?Tongaonkar抗原性預測、Parker親水性預測分析。

4.利于如權利要求1所述的抗原決定簇制備而得的抗原CVB-CP-A、抗原CVB-CP-B。

5.抗原的制備方法，其特征在于：

抗原CVB-CP-A的制備方法為：將CVB-CP-A相對應的DNA序列根據大腸桿菌密碼子的偏愛性進行優化，連接表達載體pET-41a(+)，轉化至E.coli?BL21(DE3)菌株，經IPTG誘導和Ni-NTA重力柱層析獲得了純化的大小約為38kDa的融合蛋白，得到抗原CVB-CP-A；

在CVB-CP-B末端添加一個半胱氨酸(C)，與KLH偶聯，得到抗原CVB-CP-B。

6.利于如權利要求4所述的抗原制備而得的抗體，其特征在于：利用CVB-CP-A制備而得抗體Ab-CVB-CP-A、利于抗原CVB-CP-B制備而得抗體Ab-CVB-CP-B。

7.抗體的制備方法，其特征在于：以抗原CVB-CP-A/CVB-CP-B作為免疫原，免疫新西蘭白兔制備抗血清，共進行4次免疫，最后一次免疫完成7天后采集全血，分離得到抗血清；抗血清用Protein?A親和純化后，對應得到濃縮后的抗體Ab-CVB-CP-A/Ab-CVB-CP-B。

8.如權利要求6所述的抗體在檢測菊花B病毒中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：以菊花作為待測品，采用Dot-ELISA方法進行菊花攜帶CVB的檢測。