[發明專利]一種NK細胞凍存液及其凍存方法和應用

在審

• 申請號: 202310193557.0
• 申請日: 2023-02-23
• 公開（公告）號: CN116058364A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 張繼帥;羅燕平;李劍梅
• 申請（專利權）人: 深圳普瑞金生物藥業股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 張黎

本發明公開了一種NK細胞凍存液及其凍存方法和應用，涉及生物醫學技術領域。所述的NK細胞凍存液由CS10和人血清白蛋白組成；所述的CS10和人血清白蛋白的體積比為(1?5)：1。本發明還提供了一種NK細胞的凍存方法，所述的凍存方法包括以下步驟：(1)將CS10和人血清白蛋白按照體積比進行混合，得NK細胞凍存液；(2)向NK細胞中加入NK細胞凍存液，得細胞懸液；(3)將細胞懸液分裝于凍存管中并進行程序降溫。本發明的凍存液的成分簡單，穩定性好，提高了細胞復蘇后的活率，減少了凍存過程中對NK造成的損傷。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種NK細胞凍存液及其凍存方法和應用。

背景技術

嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor，CAR)是基于基因工程構造并表達于細胞表面的受體蛋白，由抗原識別區、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號轉導區組成。自然殺傷細胞(Natural?killer?cells，NK?cells)是人類先天免疫淋巴細胞，細胞表面含有一系列激活和抑制受體，可以快速識別并殺傷病變細胞。CAR-NK療法是基于基因工程改造的NK細胞的過繼細胞療法。其療法能規避自體CAR-T的許多缺點，如細胞因子釋放綜合征、與免疫相關的神經毒性綜合征、可及性差等。CAR-NK細胞制劑輔料的選擇尤為重要，NK細胞的凍存與T細胞相比，一般損傷較大，需篩選合適的制劑處方，保證較好的活性。

CS10是一款無血清、無動物成分的凍存液，DMSO含量為10％。該凍存液已廣泛應用于免疫細胞凍存，且有較好的凍存保護效果。FDA批準的第3款CD19導向CAR-T細胞療法Breyanzi，其制劑所用的處方為CS10，24％復方電解質，1％HSA。

DMSO?Free?GMP?grade為GMP級完全凍存液，其為無色透明澄清液體，不含DMSO、血清及動物源成分，化學成分限定且安全。并已取得美國FDA的BMF(Biological?Master?File)登記號(MF#：19364)。該凍存液已顯示出較好的凍存效果。

中國專利CN202211407542.1中公開了一種NK細胞凍存液及凍存方法，所述的NK細胞凍存液由凍存液A和凍存液B組成；所述的凍存液A包括以下體積百分比的組分：人血清白蛋白30-60％、右旋糖酐10-30％和海藻糖25-45％；所述的凍存液B包括以下組分：忍冬提取物5-10％、551-H3培養基45-50％、培養上清濃縮液4-6％、羥乙基淀粉18-20％和甘油21-25％。該發明的NK細胞凍存液添加培養上清濃縮液，能夠維持細胞凍存中和復蘇后的細胞活性，無添加異源蛋白，避免外源蛋白給細胞帶來的污染，同時將生物廢料加以應用，大大節省了凍存成本。但是該NK細胞凍存液的組成成分復雜。

中國專利CN202010240894.7中公開了一種NK細胞凍存液，所述的NK細胞凍存液是在培養基中添加葡萄聚糖和多聚賴氨酸CPLL制成。該發明的NK細胞凍存液不包括動物和人源血清，防止了人畜共患傳染病的潛在傳播或引起同種異體反應的風險；加入的葡聚糖和CPLL不僅能減少凍存和復蘇過程中冰晶對細胞的損傷，還能有效的保存細胞的殺傷活性。該發明的凍存液制備簡單，安全，有很好的應用市場，但其復蘇后細胞活率的下降幅度較大。

發明內容

本發明的目的是提供一種NK細胞凍存液，本發明通過對NK細胞凍存液中各成分的種類及含量進行篩選，使得制備的NK細胞凍存液能夠有效的保護細胞免受損傷，并且在凍存和復蘇過程中維持細胞的活性。

術語解釋：

如本文所述，術語NK細胞又稱為自然殺傷細胞，是人類先天免疫淋巴細胞。NK細胞具有抗病毒的作用，在其機體受到病毒感染時，不需要抗原刺激，就可以產生細胞因子、白細胞介素和干擾素等，對抗腫瘤的發生和病毒感染。NK細胞在腫瘤中起到很好的監視作用，會監視人體免疫壽命和腫瘤細胞的損傷情況等。NK細胞還能夠調解人體免疫功能，防止產生自身免疫性疾病以及其他免疫功能的異常。