[發(fā)明專利]一種隱球菌的鑒定方法、引物對及試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202310144307.8 | 申請日： | 2023-02-17 |
| 公開（公告）號： | CN116287388A | 公開（公告）日： | 2023-06-23 |
| 發(fā)明（設計）人： | 薛新穎;張力燁;王晨;趙晟;唐瑋;賀文聰;劉文靜 | 申請（專利權(quán)）人： | 首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645 |
| 代理公司： | 北京龍雙利達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11329 | 代理人： | 毛威;肖鸝 |
| 地址： | 100038 北*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 球菌 鑒定 方法 引物 試劑盒 | ||
本申請涉及一種隱球菌的鑒定方法、引物對及試劑盒，方法包括：獲取待測樣本的基因組DNA；通過聚合酶鏈式反應PCR對所述基因組DNA的URA5基因進行擴增以獲取擴增產(chǎn)物；對所述擴增產(chǎn)物進行sanger測序；根據(jù)所述URA5基因的562位點測序結(jié)果確定所述隱球菌的類型。本申請的隱球菌鑒定方法能夠在隱球菌的一級分型的基礎上確定隱球菌二級分型，準確判斷隱球菌的亞型從而幫助提升對隱球菌引起的疾病的早期干預與治療。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于真菌病原學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種隱球菌的鑒定方法、引物對及試劑盒。
背景技術(shù)
隱球菌是一類能夠?qū)е码[球菌病的真菌，在真菌分類學上屬于半知菌亞門、芽孢菌綱、隱球酵母科。隱球菌病是由隱球菌引起的肺部或散播性感染性疾病，主要引起肺炎、腦膜炎、皮膚或臟器感染。隱球菌的屬內(nèi)種類眾多，其中引起人類感染的主要有新生隱球菌和格特隱球菌。不同類型的隱球菌在流行病學和臨床致病過程中存在明顯差異，例如，新生隱球菌主要感染免疫抑制人群，而格特隱球菌主要感染免疫正常人群并以肺部感染為主。
由于不同類型的隱球菌的致病率以及致死率不同，判斷是哪種隱球菌引起的疾病對隱球菌病診斷和治療至關(guān)重要。因此，如何鑒定隱球菌的類型成為一項亟待解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種隱球菌的鑒定方法、引物對及試劑盒，該方法能夠在準確對VGIa型隱球菌進行鑒定，從而幫助提升對隱球菌引起的疾病的早期干預與治療。
第一方面，本申請?zhí)峁┮环N隱球菌的鑒定方法，所述方法包括：獲取待測樣本的基因組DNA；通過聚合酶鏈式反應PCR對所述基因組DNA的URA5基因進行擴增以獲取擴增產(chǎn)物；對所述擴增產(chǎn)物進行sanger測序；根據(jù)所述URA5基因的562位點測序結(jié)果確定所述隱球菌的類型。
對隱球菌的分子分型通常僅限于一級分型，即將隱球菌分為VGI、VGII、VGIV型隱球菌等。發(fā)明人基于前期的下一代測序(Next?Generation?Sequencing,NGS)及分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)VGI型隱球菌可進一步分為VGIa，VGIb，VGIc和VGId型隱球菌，即二級分型。不同亞型的隱球菌的致病性也存在明顯差異。本申請?zhí)峁┑碾[球菌的鑒定方法能夠準確鑒定隱球菌的亞型，通過對待測樣本的DNA進行的URA5基因的擴增，經(jīng)過sanger測序得到URA5基因562位點的測序結(jié)果，能夠通過該測序結(jié)果精確檢測隱球菌的亞型，換言之，該隱球菌是否是VGIa型隱球菌，由此，在臨床診斷中幫助判斷引起感染的隱球菌類型。另外，本申請?zhí)峁┑碾[球菌的檢測方法無需使用復雜、昂貴的儀器設備即可實現(xiàn)，能夠節(jié)省隱球菌的檢測成本，擴展臨床檢測的使用場景。
在一些實施例中，所述根據(jù)所述URA5基因的562位點的測序結(jié)果確定所述隱球菌的類型包括：在所述URA5基因的562位點為鳥嘌呤G的情況下，確定所述隱球菌為VGIa型隱球菌；在所述URA5基因的562位點為腺嘌呤A、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T的情況下，確定所述隱球菌為野生型隱球菌。
應理解，野生型隱球菌指除了VGIa型隱球菌以外的隱球菌。本申請的實施例中，通過檢測URA5基因的562位點是否為G，能夠準確判斷待測樣本中的隱球菌是否是VGIa型隱球菌，從而幫助診斷引起感染的隱球菌亞型。
在一些實施例中，所述PCR的反應物包括URA5正向引物和URA5反向引物；其中，所述URA5正向引物的核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示，所述URA5反向引物的核苷酸序列如SeqID?No.2所示。
在一些實施例中，在獲取所述擴增產(chǎn)物后，所述方法還包括：確認所述URA5基因擴增成功。
在一些實施例中，通過凝膠電泳法確認所述URA5基因擴增成功。
本申請實施例中，在得到擴增產(chǎn)物后，進行sanger測序前，用凝膠電泳法確認擴增是否成功，能夠避免擴增不成功即進行sanger測序?qū)е碌臅r間與成本的浪費，提高隱球菌分型的效率。
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