[發(fā)明專利]基于對(duì)向照明的光學(xué)衍射層析顯微成像方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310116803.2
• 申請(qǐng)日: 2023-02-15
• 公開（公告）號(hào): CN116337811A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 左超;周寧;陳錢;孫佳嵩;張潤(rùn)南
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/41
• 分類號(hào): G01N21/41;G01N21/47;G01N21/01
• 代理公司: 南京理工大學(xué)專利中心 32203
• 代理人: 岑丹

本發(fā)明公開了一種基于對(duì)向照明的光學(xué)衍射層析顯微成像系統(tǒng)及方法，所述方法采用LED陣列作為正向角度掃描照明光源，通過依次點(diǎn)亮LED從不同角度照射樣品，采集一系列正向角度掃描照明下的樣品強(qiáng)度圖；然后采用超連續(xù)譜激光器作為后向波長(zhǎng)掃描照明光源，通過聲光可調(diào)協(xié)濾波器進(jìn)行濾波產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的光照射樣品，采集一系列后向波長(zhǎng)掃描照明下的樣品強(qiáng)度圖。本發(fā)明采用非干涉傅里葉疊層方法將對(duì)向采集到的強(qiáng)度圖像迭代更新到三維散射勢(shì)譜中，不受散斑和寄生干涉的影響，直接恢復(fù)恢復(fù)樣品的三維折射率分布。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于光學(xué)顯微測(cè)量、三維折射率成像技術(shù)，具體為一種基于對(duì)向照明的光學(xué)衍射層析顯微成像方法。

背景技術(shù)

在生物醫(yī)學(xué)顯微成像領(lǐng)域，大部分活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本都是無色透明的，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)各部份細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，當(dāng)光波通過時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化，但這種相位差人眼無法觀察。這就需要通過一些化學(xué)或者生物手段來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，從而使其在顯微鏡下可見。由于生物細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)對(duì)有色染料吸收的吸收率不同，故最終在顯微鏡下就可以看見生物細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)出不同的生物特性。

光學(xué)衍射層析成像(Optical?Diffraction?Tomography,ODT)是一種顯微成像技術(shù)，它利用生物樣品的內(nèi)源性特性—折射率，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特征的三維可視化或定量表征。與共焦顯微鏡和光片顯微鏡等非相干熒光成像技術(shù)相比，光學(xué)衍射層析成像技術(shù)有效地避免了生物樣品中熒光染料的光毒性和光漂白，并實(shí)現(xiàn)了無創(chuàng)、無標(biāo)記的三維體積成像。因此，它已廣泛應(yīng)用于生物物理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)和微生物學(xué)。然而，傳統(tǒng)透射光學(xué)衍射層析顯微鏡中的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是，由于單個(gè)物鏡的數(shù)值孔徑所施加的有限投影角，無法測(cè)量沿軸向的某些空間頻率分量。這種限制通常被稱為缺失錐體問題，導(dǎo)致軸向分辨率比橫向分辨率差幾倍，并嚴(yán)重阻礙折射率值的重建精度。

光學(xué)衍射層析成像技術(shù)中為了記錄單個(gè)物鏡孔徑極限之外的特征頻率，解決缺失錐問題提高軸向分辨率通常有三種手段。(1)通過旋轉(zhuǎn)樣本來填充缺失的錐體(Lee?M,KimK,Oh?J,et?al.Isotropically?resolved?label-free?tomographic?imaging?based?ontomographic?moulds?for?optical?trapping[J].Light:ScienceApplications,2021,10(1):102.)。這種類型的重建具有復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)裝置，因?yàn)樾枰ㄖ频臉悠放_(tái)和樣品繞固定軸或在微流體通道(Merola?F,Memmolo?P,Miccio?L,etal.Tomographicflow?cytometrybydigital?holography[J].Light:ScienceApplications,2017,6(4):e16241-e16241.)中的旋轉(zhuǎn)。因此，這些方法幾乎不適用于粘附在基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞，對(duì)于活細(xì)胞的長(zhǎng)期觀察并不理想。(2)使用正則化約束(Lim?J?W,Lee?K?R,Jin?K?H,etal.Comparativestudyofiterative?reconstruction?algorithms?for?missing?cone?problems?inoptical?diffraction?tomography[J].Optics?express,2015,23(13):16933-16948.)或深度學(xué)習(xí)(Chung?H,Huh?J,Kim?G,et?al.Missing?cone?artifact?removal?in?ODT?usingunsupervised?deep?learning?in?the?projection?domain[J].IEEETransactions?onComputational?Imaging,2021,7:747-758.)緩解缺失錐體問題。然而，這種類型的方法基于樣品折射率分布以及實(shí)驗(yàn)儀器固有屬性的先驗(yàn)知識(shí)，忽略了光與被測(cè)樣品之間的物理相互作用，因此在真實(shí)、復(fù)雜的細(xì)胞樣品情況下缺乏通用性。(3)使用透射光學(xué)衍射層析結(jié)合反射光學(xué)相干層析(Optical?Coherence?Tomography,OCT)解決缺失錐問題(Krauze?W,Ossowski?P,Nowakowski?M,etal.Enhanced?QPI?functionality?bycombining?OCTandODT?methods[C].Quantitative?Phase?Imaging?VII.SPIE,2021,11653:19-24.)。然而雖然反射光學(xué)相干層析技術(shù)確實(shí)可以接收用于填充軸向光譜的反向散射場(chǎng)，但它僅適用于生成強(qiáng)反向散射信號(hào)的強(qiáng)散射樣本，這與我們光學(xué)衍射層析中測(cè)量的對(duì)象的弱散射條件相沖突。并且，光學(xué)相干層析技術(shù)依賴干涉測(cè)量，會(huì)引入額外的干涉噪聲，并且需要搭建干涉所需的參考光路，難以耦合到現(xiàn)有的商用顯微技術(shù)中。