[發(fā)明專利]一種AscI限制性內(nèi)切酶的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310109337.5
• 申請日: 2023-02-14
• 公開（公告）號: CN115975987A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何騰飛;齊金才;柳偉強;郭鑫緣;許映沖;楊平
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州泓迅生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種AscI限制性內(nèi)切酶的制備方法，包括以下步驟：步驟一、合成AscI.M?R限制?修飾系統(tǒng)的編碼基因，構(gòu)建至原核表達載體，獲得重組載體，所述AscI.M?R限制?修飾系統(tǒng)編碼基因的DNA序列如SEQ?ID?NO:5所示；步驟二、將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，獲得重組菌；步驟三、AscI限制性內(nèi)切酶的誘導(dǎo)表達與純化。本發(fā)明通過密碼子優(yōu)化來調(diào)整修飾酶與限制酶的表達量，只需構(gòu)建一個質(zhì)粒即可實現(xiàn)兩種蛋白等量并同步表達，能夠在較短時間內(nèi)制備得到高純度、高活性的AscI限制性內(nèi)切酶，操作流程簡化，成本低，成功率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種AscI限制性內(nèi)切酶的制備方法。

背景技術(shù)

細菌防御系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和對其分子機制的深入研究，推動了生物學(xué)工具的發(fā)展，甚至整個生命科學(xué)領(lǐng)域革命性的進步。比如：細菌限制-修飾系統(tǒng)中限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)，引發(fā)了基因工程的革命，成為分子克隆的必備工具。限制性修飾系統(tǒng)(RM?system)廣泛存在于超過90％的細菌和古細菌中。為保護自身DNA不被裂解，細菌通過甲基轉(zhuǎn)移酶對自身DNA腺嘌呤或胞嘧啶進行甲基化修飾，限制性內(nèi)切酶可切割未被修飾的噬菌體基因組，阻止噬菌體DNA復(fù)制。

目前Ⅱ型限制性內(nèi)切酶被廣泛應(yīng)用于基因工程中。AscI是分枝桿菌(Arthrobacter?species)體內(nèi)的一種typeII型限制性內(nèi)切酶，特異性的識別雙鏈DNA中的“GGCGCGCC”序列并分別在雙鏈5’端之后第二個G殘基進行切割(GG^CGCGCC)，切割后的片段具有黏性末端，是遺傳及基因工程上實用性較高的限制性內(nèi)切酶種類。然而，野生型大腸桿菌中AscI酶切位點并沒有被甲基化保護，因此傳統(tǒng)的大腸桿菌中限制性內(nèi)切酶的制備方法繁瑣需要多個步驟：

1、將帶有位點特異性甲基化酶基因的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，獲得具備基底甲基化保護的重組菌；

2、制作具備基底甲基化表達的重組菌感受態(tài)細胞；

3、將融合了純化標(biāo)簽的限制性內(nèi)切酶蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入具備基底甲基化表達的重組菌感受態(tài)細胞中；

4、獲得陽性單克隆，培養(yǎng)進行限制性內(nèi)切酶的表達。

目前尚無國內(nèi)外文獻介紹限制性內(nèi)切酶AscI的重組表達與純化方法。因此，提供一種高表達量、低成本、流程簡便的高效制備AscI限制性內(nèi)切酶的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際需求，本發(fā)明提供一種AscI限制性內(nèi)切酶的制備方法，在大腸桿菌中構(gòu)建AscI.M-R限制-修飾系統(tǒng)，通過密碼子優(yōu)化來調(diào)整修飾酶AscI.M與限制酶AscI.R的表達量，只需構(gòu)建一個質(zhì)粒即可實現(xiàn)兩種蛋白等量并同步表達，操作流程簡化，成功率高。

為達上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種AscI限制性內(nèi)切酶的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、合成AscI.M-R限制-修飾系統(tǒng)的編碼基因，構(gòu)建至原核表達載體，獲得重組載體；

步驟二、將所述重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，獲得具備表達并純化的AscI限制性內(nèi)切酶重組菌；

步驟三、搖瓶培養(yǎng)進行AscI限制性內(nèi)切酶的誘導(dǎo)表達與純化。

進一步地，AscI.M-R限制-修飾系統(tǒng)的編碼基因的DNA序列如SEQ?ID?NO:5所示。

進一步地，步驟一中經(jīng)密碼子優(yōu)化AscI.M和AscI.R的氨基酸序列，得到AscI.M和AscI.R的編碼基因，以基因合成的方式合成AscI.M-R限制-修飾系統(tǒng)。