[發明專利]一種基于環境DNA技術對豹紋鰓棘鱸生物量監測的探針引物組和方法

在審

• 申請號: 202310108854.0
• 申請日: 2023-02-10
• 公開（公告）號: CN116377080A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 孫彩云;郭頤璇;刁德華;李文笙
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉婉

1.一種基于環境DNA技術對豹紋鰓棘鱸生物量監測的引物探針組，其特征在于，包括引物Pl-F、Pl-R和探針Pl-P；

所述引物的序列為：

Pl-F：5’-GTCCTTTCGATGGGTGCTGT-3’，

Pl-R：5’-TGCTGTGTAGGGTGTAACCTGT-3’；

所述探針Pl-P的序列為：5’-TCGCCATTGTCGCTGCCTTCGTGCA-3’。

2.根據權利要求1所述的引物探針組，其特征在于，所述探針5’端用FAM修飾，3’端用BHQ1修飾。

3.一種試劑盒，其特征在于，包含權利要求1或2所述的引物探針組。

4.權利要求1或2所述的引物探針組用于基于環境DNA技術對豹紋鰓棘鱸生物量監測的用途。

5.權利要求1或2所述的引物探針組在制備用于基于環境DNA技術對豹紋鰓棘鱸生物量監測的試劑盒中的用途。

6.一種基于環境DNA技術對豹紋鰓棘鱸生物量監測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以豹紋鰓棘鱸的基因組DNA為模板，PCR擴增權利要求1或2中所述引物對應的COI基因CDS片段全長；將PCR產物與克隆載體pUCm-T連接并擴大培養，提取質粒；計算質粒拷貝數并進行梯度稀釋；以梯度稀釋后的質粒為模板，利用權利要求1所述的引物探針組進行qPCR擴增，制作豹紋鰓棘鱸目的片段拷貝數與Cq值的標準曲線，并確定qPCR檢測下限LOD；

(2)采集不同海域環境下的水體，利用過濾法收集并提取水體中的環境DNA，以水體環境DNA作為模板，使用權利要求1所述的引物探針組進行qPCR檢測，記錄Cq值；

(3)根據步驟(1)得到的豹紋鰓棘鱸COI基因CDS片段拷貝數與Cq值的標準曲線和qPCR檢測下限LOD，以及步驟(2)得到的水體eDNA樣品的Cq值，計算出水體中豹紋鰓棘鱸eDNA拷貝數；然后將水體中豹紋鰓棘鱸eDNA拷貝數與對應的豹紋鰓棘鱸COI基因CDS片段拷貝數與Cq值的標準曲線和qPCR檢測下限LOD進行比較，據此判斷豹紋鰓棘鱸的分布和存在情況。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，質粒梯度稀釋后的目的片段拷貝數量級分別為10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴增反應體系為：豹紋鰓棘鱸基因組DNA?1μL，blend?taq?0.2μL，blend?taq?buffer?2μL，10μM正向引物Pl-F?0.5μL，10μM反向引物Pl-R?0.5μL，2mM?dNTPs?2μL，ddH₂O?13.8μL，共20μL；PCR擴增反應條件為：94℃預變性2min；94℃變性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，35個循環；72℃終延伸5min。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，qPCR擴增反應體系為：質粒DNA1μL，2×Taqman?Fast?qPCR?Master?Mix(Low?Rox)10μL，10μM正向引物Pl-F?0.4μL，10μM反向引物Pl-R?0.4μL，10μM探針Pl-P?0.2μL，ddH₂O?8μL，共20μL；qPCR擴增反應條件為：94℃3min；94℃5sec，60℃30sec，40個循環。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，qPCR反應體系為：水體環境DNA?1μL，2×Taqman?Fast?qPCR?Master?Mix(Low?Rox)10μL，10μM正向引物Pl-F?0.4μL，10μM反向引物Pl-R?0.4μL，10μM探針Pl-P?0.2μL，ddH₂O?8μL，共20μL；qPCR反應條件為：94℃3min；94℃5sec，60℃30sec，40個循環。