[發明專利]核苷酸衍生物及其使用方法

在審

• 申請號: 202310098650.3
• 申請日: 2017-05-23
• 公開（公告）號: CN116656795A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 靜岳·具;陳鑫;李曉旭;李增民;謝旻剛;閔辰·簡;史順娣;任健怡;郭誠;希夫·庫馬爾;詹姆士·J·魯索;傳娟·陶;斯蒂芬·卓庫茲;謝爾蓋·卡拉什尼科夫
• 申請（專利權）人: 紐約哥倫比亞大學董事會
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C07H1/00;C07H19/20;C07H19/10;C07H21/04
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張晶;趙赫

1.一種方法，其包括與單鏈DNA接觸，其中所述單鏈DNA與聚合酶結合，所述聚合酶又與電解質溶液中的膜包埋納米孔連接，其中單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，以及根據以下步驟確定單鏈DNA模板的序列：

(a)添加包括與錨部分連接的3'-O-可切割接頭(DTM)的四種核苷酸，其中所加入的合適的核苷酸類似物與所述單鏈DNA(模板)的下述核苷酸殘基互補：所述核苷酸殘基在5'方向上緊鄰所述單鏈DNA中的核苷酸殘基，

并通過DNA聚合酶在所述引物的3'末端核苷酸殘基處摻入從而形成DNA延伸產物，其中由于3'-O被可切割接頭和錨部分保護，僅有單個3'-O-錨可切割接頭(DTM)核苷酸將添加到所述引物中，從而阻止在該步驟中進一步摻入；

(b)將連接有對應于步驟(a)中的4種錨的不同結合分子的4種不同的納米孔標簽添加至經延伸的引物；具有標簽的合適的結合分子將與步驟(a)中摻入的3'-O-錨核苷酸共價結合或復合；

(c)跨膜施加電壓并測量由步驟(b)中形成的連接于其上標簽遷移通過納米孔所造成的跨過納米孔的電子(離子電流)變化，其中電子變化對于每種不同類型的標簽而言是不同的，從而鑒定與摻入的帶標簽的核苷酸互補的、單鏈模板DNA中的核苷酸殘基；

(d)通過用合適的切割劑處理來切割3'-O-可切割接頭連接的標簽，從而產生準備用于下一個延伸反應的游離3'-OH；

(e)對所測序的單鏈DNA的每個核苷酸殘基重復地進行步驟(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割錨核苷酸與單鏈(模板)DNA的下述核苷酸殘基互補：所述核苷酸殘基在5'方向上緊鄰單鏈DNA中與DNA延伸產物的3'末端核苷酸殘基雜交的核苷酸殘基，則在每次重復的步驟(a)中將3'-O-可切割錨核苷酸摻入前一次重復的步驟(d)產生的DNA延伸產物中，從而確定單鏈DNA的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸類似物具有下式：

其中，

符號“----”是非共價鍵；

B為堿基或其類似物；

L¹為共價接頭；

L²為共價接頭；

L⁴為共價接頭；

X為鍵、O、NR^6A或S；

R³為三磷酸酯或更高級的多磷酸酯；

R^4A為氫、-CF₃、-CC1₃、-CBr₃、-CI₃、-CHF₂、-CHCl₂、-CHBr₂、-CHI₂、-CH₂F、-CH₂Cl、-CH₂Br、-CH₂I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的雜芳基；R^6A為氫、-OH、-CF₃、-CCl₃、-CBr₃、-CI₃、-CHF₂、-CHCl₂、-CHBr₂、-CHI₂、-CH₂F、-CH₂C1、-CH₂Br、-CH₂I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的雜芳基；

R⁵為可檢測標簽、錨部分或親和錨部分；

R⁶為-CF₃、-CCl₃、-CBr₃、-CI₃、-CHF₂、-CHCl₂、-CHBr₂、-CHI₂、-CH₂F、-CH₂C1、-CH₂Br、-CH₂I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的雜芳基；

R⁷為氫或-OR^7A，其中R^7A為氫或聚合酶相容的部分；

R¹²為互補的親和錨部分結合子；

R¹³為可檢測標簽，

其中所述可檢測標簽為分子量為至少140道爾頓的熒光染料。