[發明專利]一種提高大腸桿菌魯棒性的重組菌及其構建方法

在審

• 申請號: 202310091486.3
• 申請日: 2023-02-06
• 公開（公告）號: CN116179460A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 譚在高;孫文杰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/70;C12P7/6409;C12P7/40;C12P7/22;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

本發明公開了一種提高大腸桿菌魯棒性的重組菌及其構建方法；通過將甲基乙二醛合酶基因mgsA替換為來自酵母的截短的角鯊烯合酶基因tErg9；在此基礎上將磷酸乙酰轉移酶基因pta替換為來自酸熱脂環酸芽孢桿菌的角鯊烯?藿烯環化酶基因shc，人工引入一條外源人工合成非天然膜組分hopanoids途徑，并對內源MEP途徑關鍵限速酶進行人工調控。獲得的重組菌細胞膜中包含全新的非天然膜組分，使其細胞膜得到重塑，重組工程菌的耐受性和產物合成能力得到顯著提高。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及微生物合成生物學領域，具體涉及一種提高大腸桿菌魯棒性的重組菌及其構建方法，尤其涉及一種提高大腸桿菌耐受性和產物合成能力的重組菌及其構建方法。

背景技術

生物質是一種可再生的清潔資源，通過生物制造技術，可以被轉化為燃料、大宗化學品和天然產物，從而部分替代石油化工煉制和植物提取。目前，在工業生物技術中，一些重要的微生物，包括細菌和酵母，已經被廣泛應用于發酵過程，作為細胞工廠以生產藥品、保健品、酶、食品成分、燃料和生物化學品(Marta?Tous?Mohedano?et?al.,2022)。為了滿足商業需求，微生物細胞通常需要被改造，用于有效地生物合成有價值的化學物質，最終實現特定的指標，如效度、產量和生產力。微生物發酵具有成本低、無化學殘留物、產量高等明顯優點，被認為是生物制造的核心，而其中的大腸桿菌由于具有遺傳背景清晰、生理背景明確、易于培養、迭代時間短、遺傳操作手法成熟等一系列優點，被作為最常用的底盤細胞廣泛用于微生物細胞工廠的構建。

生物制造的核心技術是構建高效的微生物細胞工廠，將生物質原材料轉化為各種終端產品。但是微生物細胞工廠在生產化合物的過程中，往往會暴露在各種不同的脅迫中，這些壓力來自原料、新陳代謝或工業生產過程，如上游生物質衍生糖(例如纖維素水解液)制備過程中產生的呋喃以及酚類化合物等雜質，生產過程積累的有毒中間體、不良副產物，下游發酵過程中存在的高溫、酸堿、高鹽等不利的工業條件，所合成的終產物對細胞自身的反噬，這一系列不利條件會對細胞工廠產生毒害作用，從而極大的限制菌株的生長和產物合成能力。

研究表明，合成產物引起E.coli細胞毒害的機制有多種，包括導致細胞膜損傷、DNA損傷、引起蛋白質變性和誘導活性氧(ROS)的產生等。盡管不同化合物對細胞的毒性機制各有不同，但細胞膜的損傷被認為是多種化合物引起細胞毒害的重要共性機制。E.coli細胞膜細胞膜作為細胞屏障，負責維持細胞內微環境穩定，并參與同外界環境進行物質交換、能量運輸和信息傳遞的過程；另外，細胞膜上含有豐富的酶系，執行許多重要的代謝功能，對維持和調節細胞生理和代謝至關重要。因此，構建魯棒性的E.coli細胞膜，提高其面對有毒產物和底物時的耐受性，是解決細胞膜損傷這一問題的有效策略。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種提高大腸桿菌魯棒性的重組菌及其構建方法。本發明通過人工合成途徑將非天然膜組分引入大腸桿菌，通過重塑E.coli細胞膜改造大腸桿菌底盤細胞耐受性，構建出高效的微生物細胞工廠，能夠極大地提升目前工業微生物的發酵能力，提高其生理性能。具體來說，本發明采用CRISPR-cas9基因編輯技術，將宿主菌MG1655中編碼甲基乙二醛合酶基因mgsA替換為來自酵母的截短的角鯊烯合酶基因tErg9，并運用人工啟動子策略上調tErg9的表達；在所得重組菌基礎上采用CRISPR-cas9基因編輯技術繼續將重組菌磷酸乙酰轉移酶基因pta替換為來自酸熱脂環酸芽孢桿菌的角鯊烯-藿烯環化酶基因shc，并運用人工啟動子策略上調shc的表達，得到重組工程菌，所得到的重組大腸桿菌沒有抗性，對多種化合物抑制劑具有廣譜耐受性，能夠生產C8化合物。其中，所述人工啟動子元件為M1-93，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

第一方面，本發明提供一種魯棒性提高的重組大腸桿菌，該重組菌為引入了非天然膜組分hopanoids的重組大腸桿菌；非天然膜組分hopanoids的合成是通過大腸桿菌內源MEP途徑結合引入的外源人工合成途徑進行。