[發明專利]E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒及其制備方法、疫苗

在審

• 申請號: 202310089247.4
• 申請日: 2023-02-06
• 公開（公告）號: CN116590241A
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 向程威;楊澤坤;王婷;楊潔;陳瑞愛
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/40;A61K39/245;A61K39/12;A61P31/22;A61P31/14
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 李素蘭

本發明涉及分子生物學技術領域，具體公開了一種E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒及其制備方法、疫苗。本發明制備了突變質粒E?DⅠD37N?R166K，進而構建了E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒株rDTMUV?E?DⅠD37N?R166K。該毒株可為后續抗鴨坦布蘇病毒的藥物、疫苗的制備提供了良好的平臺。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒及其制備方法、疫苗。

背景技術

鴨坦布蘇病毒(DTMUV)可導致鴨產蛋量大幅下降，死亡率大幅上升，傳統疫苗保護效力差，需要多次接種，給養鴨業帶來了巨大的經濟負擔。DTMUV屬于黃病毒屬，黃病毒科。其基因組只有一個長的獨立開放閱讀框，編碼3個結構蛋白：核衣殼(C)、膜(M)和包膜(E)；以及7個非結構蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4BNS5。其中，E蛋白的N糖基化對于病毒的復制、感染性及毒力有重要影響。目前現有文獻對于E蛋白N-糖基化的研究都是針對糖基化位點的缺失，如宰俊杰通過對日本乙型腦炎病毒E蛋白第154位氨基酸進行突變，導致了該處糖基化位點的缺失，發現突變后的質粒表達的絕大部分E蛋白構象被破壞，無法被正確折疊，而僅少數的E蛋白具有正確構象，其折疊效率被大打折扣。而增加的糖基化位點對病毒毒力是否會有影響還需進一步研究。因此，構建E基因突變的鴨坦布蘇病毒具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于，提供了一種E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒及其制備方法、疫苗，其實現了E基因的突變，為后續疫苗的研究提供了基礎。

本發明還要解決的技術問題在于，提供上述的突變鴨坦布蘇病毒的應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒的制備方法，其包括以下步驟：

(1)提供/制備含有E基因片段的質粒；

(2)采用核苷酸序列如SEQ?ID?No.1～4所示的引物，以含有E基因片段的質粒為模板進行PCR擴增，得到E-R166K片段和E-D37N片段；

(3)將所述E-R166K片段、E-D37N片段同源重組，得到突變質粒E?DⅠD37N?R166K；

(4)將所述突變質粒E?DI?D37N?R166K與pF2質粒、pF3質粒、pF4質粒連接，轉錄為RNA后轉染細胞，即得到E基因突變的重組鴨坦布蘇病毒。

作為上述技術方案的改進，其特征在于，步驟(1)中，所述含有E基因片段的質粒為pF1質粒。

作為上述技術方案的改進，步驟(2)中，采用核苷酸序列如SEQ?No.1和SEQ?No.4所述的引物對pF1質粒進行PCR擴增，得到E-D37N片段；

其中，PCR反應體系包括：2×MAX?Buffer?10μL，dNTP?4μL，引物各1μL，pF1質粒1μL，Phanta?Max?Super-Fidelity?DNA?Polymerase?0.5μL，水32.5μL；

PCR反應條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸8min，共32個循環；最后72℃延伸10min。

作為上述技術方案的改進，步驟(2)中，采用核苷酸序列如SEQ?No.2和SEQ?No.3所述的引物對pF1質粒進行PCR擴增，得到R166K片段；

其中，PCR反應體系包括：2×MAX?Buffer?10μL，dNTP?4μL，引物各1μL，pF1質粒1μL，Phanta?Max?Super-Fidelity?DNA?Polymerase?0.5μL，水32.5μL；

PCR反應條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸8min，共32個循環；最后72℃延伸10min。