[發明專利]基于人naive多能性誘導系統的體外類囊胚構建方法

在審

• 申請號: 202310088913.2
• 申請日: 2023-02-09
• 公開（公告）號: CN116083346A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 高紹榮;畢焱;王譯萱;涂志奮
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 唐麗莎

1.一種通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，所述的方法包括：

S1，獲取體外培養的人primed態多能干細胞；

S2，采用5iLAF培養基培養人primed態多能干細胞轉變為primed-態轉化過程中的細胞，記為起始點day0；

S3，收取培養至190-200小時的primed-態轉化過程中的細胞；

S4，將AggreWell^TM400微孔培養板使用抗粘附沖洗液處理20分鐘以上，棄掉液體；

S5，使用類囊胚誘導培養基重懸步驟S3獲得的細胞，同時補充Rock抑制劑，混勻，轉移至上述處理過的微孔培養板中；

S6，將微孔培養板置于37℃細胞培養箱培養至少6天。

2.根據權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，步驟S1中，將人primed態多能干細胞先消化成單細胞，然后分布在胚胎成纖維細胞上，使用hESM培養基培養不超過24小時。

3.根據權利要求2所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，所述的胚胎成纖維細胞是絲裂霉素處理過的胚胎成纖維細胞；分布在胚胎成纖維細胞上的人primed態多能干細胞的密度為60mm的皿上種5-10萬個細胞；或者，使用hESM培養基培養時間為12-24小時。

4.根據權利要求2所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，所述的胚胎成纖維細胞是小鼠胚胎成纖維細胞；或者，使用hESM培養基培養時間范圍是18-22小時。

5.根據權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，步驟S3中，收取在5iLAF培養基中培養至192-198小時的primed態-態轉化過程中的細胞。

6.根據權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，步驟S4中，所述的微孔培養板是STEMCELL公司的AggreWell^TM400微孔培養板；或者，使用抗粘附沖洗液處理30-60分鐘。

7.根據權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，步驟S5中，所述的Rock抑制劑為Y-27632；或者，Rock抑制劑的終濃度為0-30μM。

8.根據權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法，其特征在于，步驟S5中，所述的類囊胚誘導培養基的配置體系為：

按照50ml定容；

優選地，其中，IVC培養基按照50ml的終體積配制，其組成為：

其中，NACL基礎培養基按照50ml的終體積配制，其組成為：

其中，Tbasal基礎培養基按照50ml的終體積配制，其組成為：

百分比均為體積百分比。

9.一種細胞，其特征在于，所述的細胞是權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法中，采用步驟S1-S3所獲得的細胞。

10.權利要求1所述的通過體外培養的方式建立類囊胚模型的方法的應用，其特征在于，通過體外培養的方式建立類囊胚模型。