[發明專利]顯微術中進行三維成像的方法、裝置和顯微鏡

在審

• 申請號: 202310087884.8
• 申請日: 2023-01-28
• 公開（公告）號: CN116560063A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: T·卡爾克布倫納;J·西本摩根
• 申請（專利權）人: 卡爾蔡司顯微鏡有限責任公司
• 主分類號: G02B21/36
• 分類號: G02B21/36;G02B21/00;G02B21/02;G02B21/06
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 王蕊瑞

本發明涉及用于顯微術中的三維成像的方法，其中借助于校正元件在檢測光路中校正來自樣本的檢測輻射的像差；以空間分辨的形式捕獲校正的檢測輻射。該方法的特征在于，確定校正元件的最佳可能校正設置，通過最佳可能校正設置，在最佳可能校正設置時出現的像差得以盡量減少；并且基于最佳可能校正設置，確定缺陷校正設置，在缺陷校正設置下出現的像差導致檢測輻射的不對稱點擴散函數。確定在缺陷校正設置下出現的不對稱PSF，并且引發所確定的缺陷校正設置。二維地獲取樣本的圖像數據，并且基于不對稱PSF的不對稱性的相應被捕獲的顯現，在不同情況下將檢測光路的光軸方向上的位置至少分配給選定的圖像數據。本發明還涉及用于顯微術的裝置和顯微鏡。

技術領域

本發明涉及使用不對稱點擴散函數(PSF)在顯微術中進行三維成像的方法。本發明還涉及用于實施該方法的裝置和顯微鏡。

背景技術

在顯微技術領域，特別是當使用生物樣本的標記結構和分子(物體)成像時，需要高圖像分辨率，同時需要對樣本和待成像的物體具有低水平的應力。如果圖像數據的捕獲(圖像記錄)發生在很長的照明時段內和/或發生多次，最小化樣本上的應力是特別有利的。例如，當要檢測和捕獲(追蹤)一個或多個物體在特定時段內的位置變化時，使用這種照明方案。

從現有技術中已知，用光片來照明樣本在本質上僅激發了薄的照明平面中的標記物體，用于發射檢測輻射(參見例如DE?10?2016?212?020?A1)。借助于照明輻射而激發的該物體在照明平面內的位置可以借助于空間分辨(二維)檢測器(相機)來確定，并且以這種方式可以二維地定位各個檢測輻射的來源。

為了獲得關于檢測光路的光軸方向(Zc方向；3D)上的原點位置的二維(2D)定位信息，可以以這樣的方式修改點擴散函數，即：使得點光源的成像的旋轉位置和/或輪廓形狀可以用于推斷點光源的Zc位置。

例如，可以從檢測物鏡的焦點位置偏移地輻射光片，并且分析點光源的成像的輪廓形狀，以便確定所捕獲的點光源的Zc位置(DE?10?2013?208?926?A1)。

也有可能借助于相應設計的掩模(雙螺旋法)將PSF形成為雙螺旋，使得點光源被成像為兩個獨立的光點。這些點相對于彼此的相對旋轉位置允許確定相關的Zc位置(WO2021/039636?A2；帕瓦尼(Pavani)等，2009：“利用雙螺旋點擴散函數的超越衍射極限的三維單分子熒光成像(Three-dimensional，single-molecule?fluorescence?imagingbeyond?the?diffraction?limit?by?using?a?double-helix?point?spread?function)”；PNAS?106：29954-2999)。

根據現有技術的解決方案的缺點是生成雙螺旋PSF所需的昂貴的掩模，以及根據DE?102013208926A1的解決方案可應用的光學裝置的非常有限的范圍，其中，特別地，檢測光路的光軸傾斜地穿過具有不同折射能力的單獨的層，例如使用倒置顯微鏡時就是這種情況。

發明內容

本發明基于提出一種方法的目的，利用該方法減少了現有技術的缺點，并且使得具有高分辨率的三維成像成為可能。本發明的目的還在于提出一種合適的裝置，特別是光學裝置和具有這種裝置的顯微鏡，可以借助于該裝置執行該方法。

該目的通過獨立和備選獨立權利要求的主題來實現。從屬權利要求的主題是有利的發展。