[發(fā)明專利]基于KASP技術(shù)開發(fā)的特異性分子標(biāo)記用于南豐蜜桔蜜廣1號品種鑒定

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310075539.2
• 申請日: 2023-01-14
• 公開（公告）號: CN116024378A
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳巨勛;伊華林;李夢圓;徐宸宇
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗

本發(fā)明公開了一種鑒定南豐蜜桔蜜廣1號品種的分子標(biāo)記引物，基于KASP技術(shù)開發(fā)的核心SNP標(biāo)記引物可以將蜜廣1號、桂橘一號和火桔與其他南豐蜜橘品種區(qū)分，再結(jié)合SSR引物在蜜廣1號、桂橘一號和火桔的多態(tài)性擴增條帶，可快速鑒定出蜜廣1號，該引物可應(yīng)用于南豐蜜桔蜜廣1號輔助鑒定和驗證種苗純度等方面。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于遺傳育種及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為鑒定南豐蜜桔‘蜜廣1號’品種的分子標(biāo)記引物及應(yīng)用。

背景技術(shù)

南豐蜜桔(Citrus?reticulate‘Kinokuni’)是原產(chǎn)于我國的地方特色桔類品種，因其果小皮薄、汁多無渣、味甜易剝等特點享有“桔中之王”的美譽。南豐蜜桔作為我國寬皮橘類中的優(yōu)良品種常年出口至東南亞等國家，為南豐當(dāng)?shù)毓r(nóng)帶來了頗為可觀的種植收益。南豐蜜桔栽培歷史悠久，經(jīng)長期的自然發(fā)展于原產(chǎn)地周邊形成了豐富的變異資源，諸如‘早熟系’、‘桂花蒂’、‘大果系’、‘小果系’、‘南豐紅廣’和‘南豐蜜廣1號’等品系。不同品系南豐蜜橘間的外觀相似，單從形態(tài)學(xué)上難以進行分辨，直接限制了南豐蜜橘品種的優(yōu)化利用。因產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，南豐縣聯(lián)合地方農(nóng)業(yè)科研部門對全縣柑橘種植資源類型進行調(diào)查，初步將南豐蜜桔分為傳統(tǒng)南豐蜜橘和帶有南豐蜜橘血統(tǒng)的南豐廣橘兩大類。蜜廣1號品系就屬于南豐廣橘一類，其具有早結(jié)豐產(chǎn)、抗逆性強、汁多化渣等特點。但因裂果較嚴重，在早期僅為零星種植。1989年南豐遭遇極端低溫凍害，當(dāng)?shù)啬县S蜜桔株系大面積受凍死亡。蜜廣1號品系抗寒性較強，受凍情況較輕，隨即受到了科研部門的重視并開始對蜜廣1號品系進行選優(yōu)。經(jīng)過連續(xù)十余年的選育，現(xiàn)已形成穩(wěn)定品質(zhì)產(chǎn)量特性的優(yōu)良蜜廣1號蜜橘品種。但受限于早期鑒定技術(shù)，南豐蜜桔各品系混雜，同名異物、同物異名的問題十分普遍，同時市場上假冒偽劣蜜廣1號種苗和果實的現(xiàn)象十分嚴重，嚴重侵害了種植戶與消費者的權(quán)益。因此，目前迫切需要可穩(wěn)定用于快速區(qū)分蜜廣1號品種的鑒定方法。

目前多數(shù)柑桔新品種均來源于自然芽變，如何準確、快速地對芽變材料進行鑒定，這對于新品種保護及推廣具有重要意義。傳統(tǒng)鑒定芽變材料的方法主要通過形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)和生化層面進行的，但存在著易受環(huán)境干擾、多態(tài)性較差以及區(qū)分度不高等弊端。鑒于市場中苗木品質(zhì)良莠不齊和苗木不純等現(xiàn)象頻發(fā)，目前僅借助傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)已無法滿足新品種鑒定需求，限制了產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展。

分子標(biāo)記技術(shù)直接以DNA序列差異為研究對象，從分子層面反映遺傳物質(zhì)的變化，與其它鑒定方法相比具有高效性、便捷性以及高多態(tài)性等諸多優(yōu)良特性，SSR(簡單重復(fù)序列標(biāo)記)和SNP(單核苷酸多態(tài)性)均有變異位點豐富、多態(tài)性高、鑒定結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點，已逐漸成為芽變鑒定的首要手段。根據(jù)鑒定材料特性選擇適宜的分子標(biāo)記類型并建立對應(yīng)的品種指紋圖譜，可為后期品種真實性檢測和苗木快速鑒定提供相應(yīng)的技術(shù)支撐。分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用對于打擊種苗假冒偽劣、保護育種人員和種植戶利益、提高市場監(jiān)管效率、維護產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

KASP基因分型技術(shù)是基于引物末端堿基的特異性匹配、PCR技術(shù)和熒光檢測對SNPs進行分型檢測。KASP反應(yīng)體系中包括2條特異性正向引物，正向引物的3'末端分別和SNP位點相對應(yīng)，進行PCR擴增時相互競爭，5'末端分別添加特異熒光序列，還包括一條通用的反向引物。KASP相較于其他SNPs檢測技術(shù)相比具有準確率高、穩(wěn)定性好以及成本低等優(yōu)點，已在柑桔、蘋果、玉米等園藝作物品種鑒定上得到了廣泛的應(yīng)用。

南豐蜜桔‘蜜廣1號’品種具有早結(jié)豐產(chǎn)、抗寒性強、汁多化渣等特點。其成熟期在11月上中旬，成熟時果實果皮色澤呈黃橙色，單果重約44.88克，可溶性固形物13～16％，可滴定酸0.68％，VC含量為25.64mg/100g，可食率77.59％，果實無籽。穩(wěn)果后畝產(chǎn)可達3500公斤以上，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性良好，大小年現(xiàn)象不明顯。開發(fā)針對于‘蜜廣1號’南豐蜜桔的特異性分子標(biāo)記，有利于從分子水平上將該品種與目前主栽的南豐蜜桔品系進行區(qū)分界定，同時可為品種保護與快速鑒定提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種基于KASP技術(shù)開發(fā)的核心SNP標(biāo)記引物并結(jié)合SSR分子標(biāo)記技術(shù)共同用于南豐蜜桔‘蜜廣1號’品種快速鑒定的方法。